電子順磁共振測(cè)量蛋白質(zhì)分子內(nèi)選定位點(diǎn)之間距離的方法及應(yīng)用

吳 可

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850

電子順磁共振測(cè)量蛋白質(zhì)分子內(nèi)選定位點(diǎn)之間距離的方法及應(yīng)用

吳 可

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850

蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了其特性和功能，準(zhǔn)確測(cè)量蛋白質(zhì)分子中特殊位點(diǎn)之間的距離對(duì)其結(jié)構(gòu)解析至關(guān)重要。該文在簡(jiǎn)要介紹電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）方法測(cè)量蛋白質(zhì)分子內(nèi)未偶自旋之間距離基本原理的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述了近年來EPR結(jié)合定點(diǎn)自旋標(biāo)記（site-directed spin label，SDSL）技術(shù)在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能方面的應(yīng)用情況，歸納了EPR-SDSL方法測(cè)量距離的特點(diǎn)和存在問題，并提出了改進(jìn)用連續(xù)波EPR技術(shù)測(cè)量距離的準(zhǔn)確度的思路和實(shí)現(xiàn)方法。

電子順磁共振；定點(diǎn)自旋標(biāo)記；距離測(cè)量；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

0 引 言

蛋白質(zhì)分子中功能集團(tuán)的位置、取向、運(yùn)動(dòng)及其變化在其發(fā)揮生物功能的活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。近年來，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的迅速進(jìn)展，促成了蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫新蛋白數(shù)量大量增加，其中包括大量膜蛋白，而相應(yīng)的膜蛋白結(jié)構(gòu)的分析研究卻相對(duì)進(jìn)展緩慢。由于蛋白構(gòu)象變化是膜蛋白執(zhí)行特定功能的基本要素，所以僅從靜態(tài)結(jié)構(gòu)分析往往難以完全解釋許多功能性蛋白質(zhì)的作用機(jī)制。膜蛋白的運(yùn)動(dòng)常用一些假設(shè)的運(yùn)動(dòng)形式來描述，如：膜受體、離子泵、離子通道等蛋白質(zhì)的復(fù)雜的功能性運(yùn)動(dòng)可以形象地描述為一些蛋白質(zhì)子結(jié)構(gòu)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)過程，然而在溶液環(huán)境下，對(duì)于膜蛋白發(fā)揮生物功能過程中的構(gòu)象變化目前尚缺乏高分辨的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)來表征。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）結(jié)合定點(diǎn)自旋標(biāo)記技術(shù)可能成為解決這一重要卻相對(duì)復(fù)雜問題的有效方法?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以有目的地將蛋白質(zhì)分子中特定位點(diǎn)的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，這樣就可以在這些位點(diǎn)處標(biāo)記上可與巰基（-SH）特異結(jié)合的順磁性標(biāo)記物，這就是定點(diǎn)自旋標(biāo)記（site-directed spin label，SDSL）技術(shù)。如用一對(duì)氮氧基分別標(biāo)記在兩個(gè)特定位點(diǎn)，兩個(gè)氮氧基間將產(chǎn)生偶極相互作用，其作用強(qiáng)度與兩個(gè)氮氧基間距離的立方成反比，則通過分析EPR波譜的偶極增寬效應(yīng)，可以確定氮氧基之間的距離，這種方法為研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能提供了新的分析手段。

目前可以測(cè)量蛋白質(zhì)分子內(nèi)距離的主要方法有X射線晶體衍射和核磁共振（NMR）技術(shù)等。X射線晶體衍射的分辨率較高，可達(dá)到0.12 nm，但由于許多具有生物學(xué)活性的蛋白系統(tǒng)（如：含有金屬離子或與膜結(jié)合形成了蛋白復(fù)合物）難以獲得結(jié)晶樣品，而且多數(shù)蛋白質(zhì)都是在溶液環(huán)境中并不是以結(jié)晶狀態(tài)下發(fā)揮生物功能，只能在溶液或冰凍溶液狀態(tài)下分析，在這些情況下，X射線晶體衍射方法會(huì)受到限制，給出的結(jié)果不能完全反映蛋白質(zhì)實(shí)際發(fā)揮功能時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。二維NMR技術(shù)可以在溶液狀態(tài)下測(cè)量蛋白質(zhì)的距離，但NMR測(cè)距原理將其測(cè)量范圍限制在0.6 nm內(nèi)，而且NMR只適用于檢測(cè)一些小分子蛋白質(zhì)，對(duì)于大量具有生物活性的膜蛋白和大分子蛋白復(fù)合體則無能為力，而獲得這些蛋白質(zhì)在發(fā)揮生物功能的溶液狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)變化信息卻是十分重要的。EPR是通過測(cè)量未偶電子的自旋-自旋相互作用強(qiáng)度獲得自旋間的距離信息，借助EPR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子上感興趣位點(diǎn)之間的距離和自旋取向的分析。其主要特點(diǎn)在于：1）EPR只對(duì)未偶電子敏感，受其它因素干擾較少；2）檢測(cè)的溫度范圍較寬，在生物樣品的活性溫度范圍內(nèi)都可用EPR檢測(cè)；3）由于電子磁矩μe比原子核磁矩μp大得多（μe/μp=658），所以利用電子磁矩相互作用效應(yīng)可測(cè)的距離更長(zhǎng)。

1 EPR測(cè)量距離原理

EPR測(cè)量未偶電子之間距離的基本原理[1]是依賴于自旋磁矩之間存在的偶極相互作用，即從一個(gè)自旋產(chǎn)生的磁場(chǎng)作用到另一個(gè)自旋磁矩的強(qiáng)度，如圖1所示。圖1中r為兩個(gè)未偶自旋磁矩μe1和μe2之間的連線。在隨機(jī)分布情況下，r與外加磁場(chǎng)B0之間會(huì)有一定的夾角θ，μe2受到從μe1產(chǎn)生的磁場(chǎng)的作用強(qiáng)度WDD為：

μ0為磁導(dǎo)率，β為波爾磁子，g1、g2分別為兩個(gè)未偶自旋的g因子。

圖1 未偶自旋相互作用及其與距離的關(guān)系Fig.1 The interaction of unpaired spins and their distance relationship

目前利用EPR測(cè)量距離的方法分為連續(xù)波（continuous wave electron paramagnetic resonance，CW-EPR）方法和脈沖電子-電子雙共振（electron-electron double resonance/double electron-electron resonance，ELDOR/DEER）方法。

1.1 連續(xù)波EPR測(cè)量距離方法

兩個(gè)未偶自旋偶極間的相互作用會(huì)使EPR原始譜線產(chǎn)生分裂變形，當(dāng)此作用強(qiáng)度明顯大于單自旋CW-EPR信號(hào)的波譜線寬時(shí)，可通過分析譜線增寬的變化得到偶極相互作用強(qiáng)度信息。但對(duì)于快速轉(zhuǎn)動(dòng)的自旋對(duì)而言，即自旋對(duì)的轉(zhuǎn)動(dòng)速度相對(duì)于用頻率表示的相互作用強(qiáng)度要快時(shí)，相互作用的空間信息被平均，則不易觀測(cè)到偶極分裂現(xiàn)象，所以實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)盡可能靈敏地檢測(cè)出偶極相互作用強(qiáng)度，并將之與影響波譜變化的其它因素有效地分開，從而從波譜中提取出距離信息。目前，連續(xù)波EPR測(cè)量距離采用最廣泛的是波譜去卷積方法。該方法將兩個(gè)相互作用的自旋電子對(duì)波譜看作由沒有相互作用的單自旋粉末譜與一個(gè)偶極增寬函數(shù)D(r,B)相卷積構(gòu)成，此增寬函數(shù)稱為“Pake”函數(shù)?？梢杂脝巫孕ㄗV對(duì)含有偶極相互作用的雙自旋增寬波譜進(jìn)行傅里葉去卷積計(jì)算，來獲得代表相互作用強(qiáng)度的增寬函數(shù)。此方法須有一前提，就是事先要獲得單自旋波譜。我們綜合了目前利用該原理的各種實(shí)際應(yīng)用方法，并針對(duì)目前這一方法還缺少距離準(zhǔn)確度的校正方法等實(shí)際問題，將其實(shí)現(xiàn)過程和需進(jìn)一步改進(jìn)之處（應(yīng)增加距離校正過程）歸納如圖2所示。

圖2 連續(xù)波EPR測(cè)量距離方法框圖Fig.2 Process frame of distance measurement by CW-EPR

用連續(xù)波EPR技術(shù)測(cè)量距離，除上述的波譜傅利葉去卷積計(jì)算方法外，還有波譜模擬法、半場(chǎng)躍遷（half-field transition）相對(duì)強(qiáng)度法、半場(chǎng)峰高比值d/d1方法等。

1.2 脈沖電子-電子雙共振(ELDOR/DEER)測(cè)量距離方法

用CW-EPR技術(shù)測(cè)量偶極相互作用依賴于波譜線寬的明顯增寬效應(yīng)。受EPR譜線自身線寬的影響，當(dāng)自旋之間距離大到一定程度時(shí)，其偶極相互作用強(qiáng)度會(huì)變得很弱，由此引起的譜線增寬效應(yīng)會(huì)下降，甚至被淹沒在各種各向異性波譜增寬效應(yīng)中，所以長(zhǎng)距離測(cè)量更多采用脈沖EPR方法。脈沖技術(shù)比連續(xù)波測(cè)量的距離更長(zhǎng)，是因?yàn)槠渚嚯x信息由自旋簇的寬度決定，此寬度與回波的相位失相干速率相關(guān)，它通常比CW-EPR波譜的非均勻增寬程度小得多。當(dāng)溫度在80 K以下時(shí)，氮氧自由基自旋回波的相位失相干時(shí)間常數(shù)Tm通常在2 μs左右，它相當(dāng)于線寬為3 μT的自旋簇。所以對(duì)CW-EPR線寬而言，相對(duì)較小的相互作用強(qiáng)度對(duì)脈沖回波自旋簇的線寬影響卻很顯著，這一特性決定了用脈沖技術(shù)測(cè)量長(zhǎng)距離更有優(yōu)勢(shì)。ELDOR/DEER是通過對(duì)一個(gè)自旋的波譜范圍進(jìn)行擾動(dòng)的同時(shí)觀測(cè)另一個(gè)自旋的時(shí)間響應(yīng)特性。偶極相互作用強(qiáng)度以多重振蕩形式調(diào)制回波強(qiáng)度，此振蕩頻率中含有自旋間距離的信息，通常需用一系列脈沖組合來完成這種測(cè)量，對(duì)特殊的自旋系統(tǒng)還須建立特殊的脈沖組合。如：3-脈沖ELDOR、2+1脈沖ELDOR序列、4-脈沖DEER、雙量子相干檢測(cè)（double quantum coherence，DQC）等。其中的4-脈沖DEER可以避免脈沖響應(yīng)死期的影響，它與DQC技術(shù)可測(cè)量的最大長(zhǎng)度均可達(dá)到8 nm。隨著距離的加大，需要樣品的濃度更低，以保證分子內(nèi)不同自旋之間的距離要比不同分子之間的距離小得多，這對(duì)脈沖儀器的檢測(cè)靈敏度提出了更高的要求。某些情況下，還需要同時(shí)激勵(lì)樣品中所有的自旋以確定全部偶極增寬函數(shù)，但目前技術(shù)很難獲得可激勵(lì)全部波譜的脈沖帶寬。當(dāng)波譜被強(qiáng)偶極相互作用顯著增寬后，這一問題就更加嚴(yán)重，所以目前脈沖技術(shù)最適合的距離測(cè)量范圍是1.5～8 nm。距離測(cè)量精度在低端大約0.3 nm，而在中段約為0.2 nm。此外，高頻EPR技術(shù)增加了取向選擇性的范圍，所以目前許多工作已應(yīng)用Q波段甚至W波段DEER方法。

1.3 距離分布

許多系統(tǒng)中未偶自旋間的距離不是一個(gè)固定值而是存在一個(gè)分布范圍，這一點(diǎn)在數(shù)據(jù)分析時(shí)必須考慮。即使自旋標(biāo)記物標(biāo)記在已明確了結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，由于分子的微運(yùn)動(dòng)也會(huì)使距離產(chǎn)生分布，EPR測(cè)量距離主要的不確定性來自于對(duì)距離分布情況的處理，關(guān)鍵是要根據(jù)相互作用強(qiáng)度對(duì)距離的依賴關(guān)系和標(biāo)記物分子或自旋中心的取向因素，得到合理的分布函數(shù)，否則會(huì)導(dǎo)致測(cè)量的準(zhǔn)確度比預(yù)期低。另外，蛋白分子的未完全標(biāo)記是EPR測(cè)量距離誤差的另一主要來源。綜合考慮各因素，通常認(rèn)為EPR測(cè)量距離的誤差約0.2 nm。

2 距離測(cè)量在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用

大量研究表明，EPR-SDSL在解決復(fù)雜蛋白質(zhì)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)、構(gòu)象變化及與周圍環(huán)境相互作用等機(jī)制方面，可以提供其它方法無法獲得的重要信息，它是對(duì)X射線晶體衍射和NMR方法很好的補(bǔ)充，解決了許多蛋白質(zhì)研究中的熱點(diǎn)問題，如：難以獲得結(jié)晶的膜蛋白和大分子蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)的區(qū)域折疊狀態(tài)、溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與其它生物大分子之間的相互作用等。這一技術(shù)近年來得到了很快發(fā)展和廣泛應(yīng)用[2～8]。Hubbell等[9,10]開展EPR-SDSL分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)的工作較早。Voss等利用此技術(shù)測(cè)量了大腸桿菌膜上乳糖通透酶蛋白上的金屬離子與自旋標(biāo)記之間的距離。通過在螺旋體上定點(diǎn)自旋標(biāo)記，利用未偶自旋磁矩與螺旋體3和4之間的金屬離子相耦合作用，確定了突變點(diǎn)103、111、121與金屬離子間的距離分別為0.8、1.4、2.3 nm，這一結(jié)果與通透酶跨膜域的螺旋體構(gòu)象相符合[11]。對(duì)離子通道MscL在受到刺激信號(hào)后的結(jié)構(gòu)重組過程和其開閉控制機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)了開啟狀態(tài)的高運(yùn)動(dòng)性導(dǎo)致第一個(gè)跨膜螺旋體TM1相連形成水填充孔[7]。通過測(cè)量距離信息，可以計(jì)算出膜蛋白的構(gòu)象變化，例如在鏈霉菌鉀離子通道 (KcsA)上構(gòu)建10對(duì)半胱氨酸殘基，測(cè)量各殘基對(duì)之間距離的變化，在通道閉合時(shí)最小距離為0.85 nm，最大大于2.5 nm；開啟時(shí)最小距離1.1 nm，最大距離2.4 nm，各殘基對(duì)間最大距離差可達(dá)0.94 nm，檢測(cè)誤差約為0.1 nm，從而獲得了KcsA的第二個(gè)跨膜域 (TM2)在通道開啟過程中的構(gòu)象改變。確定了通道開啟過程是通過MT2段以中央螺旋為軸的剪刀型運(yùn)動(dòng)完成的，這一方法大大減少了膜蛋白構(gòu)象變化的分析時(shí)間和難度[12]。通過檢測(cè)對(duì)配體依賴型藥物傳輸體MsbA構(gòu)象的變化，建立了與ATP結(jié)合的抗多藥物傳輸體的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。X射線衍射法不能檢測(cè)肌球蛋白因磷酸化作用而引起的結(jié)構(gòu)改變，通過點(diǎn)突變?cè)诩∏虻鞍椎妮p鏈引入半胱氨酸殘基，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白N末端(前24個(gè)氨基酸)在磷酸化后運(yùn)動(dòng)性發(fā)生了顯著變化，通過偶極-偶極相互作用測(cè)定殘基間距離，用于底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜通道關(guān)閉、基因調(diào)控以及信號(hào)傳導(dǎo)的研究，可為多種類型處于部分折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)提供結(jié)構(gòu)信息[8,14]。測(cè)量分子間距和分子內(nèi)距離還可以確定蛋白與蛋白及蛋白與寡核苷酸之間的相互作用[8]；得到人血紅蛋白四聚體的構(gòu)象變化[15]；確定鈣離子誘導(dǎo)的人心肌肌鈣蛋白C與肌鈣蛋白Ⅰ復(fù)合體的N末端結(jié)構(gòu)變化[16]；區(qū)分蛋白復(fù)雜運(yùn)動(dòng)的細(xì)節(jié)及跨膜域的運(yùn)動(dòng)特征和包含蛋白體的大脂質(zhì)群與結(jié)合型脂的結(jié)構(gòu)[6]。將自旋標(biāo)記側(cè)鏈標(biāo)在視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)的反平行β折疊結(jié)構(gòu)中，測(cè)量分子內(nèi)距離證明了其運(yùn)動(dòng)性與其結(jié)構(gòu)和鄰近亞基的相互作用有關(guān)[17]。

除引用SDSL外，還可以利用蛋白質(zhì)分子中自身存在的順磁性物質(zhì)或反應(yīng)中產(chǎn)生的順磁性中間體，實(shí)現(xiàn)蛋白中特殊位點(diǎn)間距離的測(cè)量，如：利用水解酶中的[Ni-Fe]中心與周圍順磁性粒子之間的距離測(cè)量；Christopher測(cè)量人肝再生因子（ALR）在催化巰基氧化過程中產(chǎn)生的黃素自由基間的距離為(2.6±0.8)nm[18]。ALR是一種黃素依賴型巰基氧化酶二聚體，利用分子氧催化巰基氧化生成二硫鍵，同時(shí)產(chǎn)生中性的黃素自由基，這一結(jié)果與晶體分析得到的大鼠ALR結(jié)構(gòu)近似，從而確定了可以用大鼠ALR結(jié)構(gòu)作為人ALR的研究模型。Bennati等[19]研究了大腸桿菌核糖核酸還原酶在催化核酸磷酸化變?yōu)槊撗鹾颂请p磷酸過程中，功能蛋白質(zhì)（RNR）分子中兩個(gè)獨(dú)立二聚體單元R1亞基的酪氨酰自由基與R2亞基中的一個(gè)氮中心自由基（N3UDP）之間的距離變化范圍。這些工作都是在不用外源標(biāo)記物的情況下完成的。

近年來，EPR-SDSL技術(shù)更多地應(yīng)用于研究膜結(jié)合蛋白等復(fù)雜生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性變化，特別是在解釋蛋白質(zhì)的功能細(xì)節(jié)上取得了效果。如：在研究ATP結(jié)合體ABC傳運(yùn)器BTuCD將VB12從胞外結(jié)合體BTuF傳輸至大腸桿菌胞內(nèi)過程中，觀察到BTuCD和BTuF的結(jié)構(gòu)均發(fā)生較大的變化，與2.6 nm結(jié)晶結(jié)構(gòu)相吻合[4]；流感病毒A上pH激活型質(zhì)子通道M2蛋白跨膜區(qū)的38個(gè)殘基和C端延伸區(qū)，在pH變化時(shí)會(huì)在膜表面形成螺旋體，距離變化信息表明其中的49位賴氨酸發(fā)揮著重要作用[2]；用EPR和NMR相結(jié)合解析膜蛋白上流感病毒融合域的結(jié)構(gòu)，確定了膜外端蛋白N端對(duì)于膜融合及維持跨膜結(jié)構(gòu)的重要性[20]；發(fā)現(xiàn)了輔酶Q氧化還原酶（呼吸復(fù)合物Ⅰ）處于膜內(nèi)和膜外的兩個(gè)臂的間距，在加入NADH時(shí)會(huì)加大，但對(duì)NADPH不敏感，兩個(gè)臂都存在NADH依賴型的構(gòu)象變化[21]；確定嵌入在脂質(zhì)體中鉀離子通道的壓控感受器的結(jié)構(gòu)[22]；在溶液狀態(tài)下分析蛋白（apoA-Ⅰ）N端異構(gòu)體結(jié)構(gòu)[23]；通過氮氧自由基偶極間的相互作用建立蛋白的錐狀空間構(gòu)象模型等[24]。

某些樣品中存在膜及色素等對(duì)光的傳輸有擾動(dòng)的成分，不宜用光學(xué)方法分析，但可用EPR方法解決。如Hubbell的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出視網(wǎng)膜色素感光刺激后螺旋體結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，并開展了視網(wǎng)膜蛋白在光驅(qū)動(dòng)下的運(yùn)動(dòng)性和構(gòu)象變化的系列應(yīng)用研究[25～29]。

脈沖電子-電子雙共振技術(shù)可以克服非均勻性增寬對(duì)距離測(cè)量精度的影響，提高距離測(cè)量范圍，成為了新的發(fā)展方向[30]。在對(duì)人輔酶Q結(jié)構(gòu)的分析中，確定多肽GA-Ⅳ在磷脂膜上的定位與聚合過程，分析膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)能量耦合結(jié)構(gòu)的底物依賴型去折疊過程等工作，證明了這一方法的先進(jìn)性[31～34]。Bennati等用脈沖DEER法研究了大腸桿菌核糖核酸還原酶在催化核酸磷酸化變?yōu)槊撗鹾颂请p磷酸過程中，功能蛋白質(zhì)的兩個(gè)子結(jié)構(gòu)R1和R2自由基間的相互作用和距離的變化，發(fā)現(xiàn)其距離變化范圍可達(dá)到4.7～5 nm。這種長(zhǎng)距離關(guān)系驗(yàn)證了原來的機(jī)制假設(shè)：催化過程是由自由基誘導(dǎo)的氨基酸通路的遷移并同時(shí)伴有較大的構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)的[19]。DEER在許多方面比連續(xù)波先進(jìn)，但DEER是相對(duì)昂貴復(fù)雜的系統(tǒng)，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室可以開展這種實(shí)驗(yàn)，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室還只能用連續(xù)波EPR開展工作，尤其我國目前還沒有脈沖雙共振設(shè)備。已有的研究表明，如果問題的切入點(diǎn)選擇得好，通過連續(xù)波EPR測(cè)量，可以做出極有價(jià)值的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析工作，所以目前兩種方法應(yīng)用都非常廣泛。

國內(nèi)目前尚未建立EPR測(cè)量距離的方法，忻文娟和趙保路教授等曾用馬來酰亞胺標(biāo)記腫瘤細(xì)胞膜蛋白的巰基研究蛋白構(gòu)象改變[34]，本實(shí)驗(yàn)室也曾開展過馬來酰亞胺標(biāo)記膜蛋白的實(shí)驗(yàn)研究[35]，但這些工作都要依賴于蛋白質(zhì)上天然存在的巰基，難以搞清標(biāo)記點(diǎn)在蛋白上的確切位置和數(shù)量，更無法得到不同位點(diǎn)之間距離的變化信息。本實(shí)驗(yàn)室近年來結(jié)合凝集素家族蛋白的研究，開展了定點(diǎn)自旋標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，在國內(nèi)啟動(dòng)了用EPR-SDSL技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的工作。已在模型蛋白上成功構(gòu)建了6個(gè)不同位點(diǎn)的半胱氨酸突變體，并實(shí)現(xiàn)了這些突變體蛋白的表達(dá)，目前正在開展SDSL標(biāo)記和EPR分析工作。

3 問題與展望

綜上可知，利用EPR-SDSL研究蛋白質(zhì)的主要優(yōu)勢(shì)在于：測(cè)量距離范圍更寬（0.5～8 nm）、測(cè)量溫度范圍更寬（4～＞300 K)、可以在溶液環(huán)境下測(cè)量、樣品不用結(jié)晶、分子量不受限制、適合測(cè)量結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)態(tài)過程等。但與其它分析方法類似，受EPR技術(shù)原理本身的限制，該方法也存在缺點(diǎn)：除少數(shù)自身含有自由基或順磁性金屬離子的蛋白樣品以外，大多數(shù)情況需要與點(diǎn)突變技術(shù)配合應(yīng)用。好在目前蛋白點(diǎn)突變已是非常成熟的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)任意位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)；再者，有些情況下，如蛋白質(zhì)本身含有功能性多半胱氨酸殘基時(shí)，則難以應(yīng)用；另外，任何對(duì)生物分子引入外源性探針類物質(zhì)而達(dá)到測(cè)量目的的方法，都要在應(yīng)用之前考慮分子的性質(zhì)是否受到了不可接受的擾動(dòng)，這已成為方法學(xué)研究中的主要問題。如：在X射線衍射分析中，當(dāng)需要加入重金屬而提高散射效果時(shí)；在熒光檢測(cè)方法中需加入熒光探針時(shí)；在EPR中，當(dāng)一個(gè)抗磁性金屬離子被順磁性離子所取代或加入氮氧自旋探針時(shí),也會(huì)對(duì)生物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或活性造成一定的擾動(dòng)。但許多研究表明，局部引入的自旋標(biāo)記物，對(duì)蛋白的功能和穩(wěn)定性的影響是很小的，有時(shí)幾乎沒有影響[10,36,37]。所以這種擾動(dòng)帶來的問題相對(duì)獲得的結(jié)構(gòu)信息而言還是可以接受的。

目前，在利用EPR-SDSL研究蛋白質(zhì)的工作中，更注重構(gòu)建蛋白質(zhì)在發(fā)揮生物功能過程中其結(jié)構(gòu)變化的細(xì)節(jié)，這在方法學(xué)上就要求進(jìn)一步提高距離測(cè)量的準(zhǔn)確度和精度。根據(jù)EPR波譜理論，EPR波譜線型變化除受偶極相互作用影響外，還受許多因素影響，如g因子的各向異性和原子核的超精細(xì)作用，都會(huì)使波譜產(chǎn)生附加的增寬效應(yīng)；此外，未偶自旋間的相對(duì)取向、蛋白質(zhì)整體的旋轉(zhuǎn)性運(yùn)動(dòng)以及標(biāo)記物分子的局部運(yùn)動(dòng)、自旋態(tài)的弛豫時(shí)間、低溫測(cè)量、溶劑極性或黏性介質(zhì)對(duì)分子運(yùn)動(dòng)的阻尼等因素，也會(huì)引起波譜線型變化。如何有效地從雙自旋標(biāo)記的連續(xù)波EPR波譜中準(zhǔn)確提取距離信息一直是該領(lǐng)域的難題。利用單/雙自旋連續(xù)波ESR波譜的去卷積運(yùn)算提取出偶極作用強(qiáng)度，再從中計(jì)算偶極間距是目前利用連續(xù)波EPR波譜計(jì)算距離的主要方法[38]，但這種波譜去卷積方法難以完全避免上述諸因素對(duì)距離準(zhǔn)確度的影響，而且去卷積計(jì)算和對(duì)增寬函數(shù)濾波處理等，也會(huì)引入誤差和信號(hào)失真，使距離結(jié)果產(chǎn)生偏差。如通過構(gòu)建尺寸確定的雙自旋化合物作為距離測(cè)量標(biāo)尺，建立不同環(huán)境下EPR波譜增寬效應(yīng)與實(shí)際雙基間距離的關(guān)系曲線，對(duì)實(shí)測(cè)的距離加以校驗(yàn)，將會(huì)改善和提高連續(xù)波EPR解析蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的準(zhǔn)確性和可信度。Jeschke曾用“炔-苯”結(jié)構(gòu)為骨架的雙自旋分子檢驗(yàn)了脈沖DEER的距離測(cè)量結(jié)果，所用分子的雙自旋間最小距離為1.93 nm，不適合連續(xù)波EPR方法使用。而且“炔-苯”骨架結(jié)構(gòu)也可能產(chǎn)生折疊或扭曲，影響尺度的精準(zhǔn)[39]。碳60和碳70（C60/C70）結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，可以構(gòu)成自由基骨架[40]，其球體結(jié)構(gòu)的直徑約為0.5 nm，恰在EPR測(cè)量距離的下限，如將C60分子連接形成不同長(zhǎng)度的剛性分子鏈，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、尺寸范圍都適合作為連續(xù)波EPR測(cè)量距離的分子標(biāo)尺。除此以外，理論上“并苯”結(jié)構(gòu)也是較理想的骨架結(jié)構(gòu)。苯環(huán)的分子尺寸比C60更小，用并苯為骨架構(gòu)建的分子標(biāo)尺將比C60鏈的距離分辨度更高。

工欲善其事，必先利其器。應(yīng)用EPR-SDSL在蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中已解決了許多重要問題。與其它方法一樣，盡管這一技術(shù)也存在局限性，但其在動(dòng)態(tài)測(cè)量和距離測(cè)量等特有的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其它技術(shù)是很好的補(bǔ)充。尤其在我國，利用現(xiàn)有EPR技術(shù)條件建立EPR-SDSL距離測(cè)量方法，可以為在溶液或生理環(huán)境下研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能建立新的研究方法，有利于在國內(nèi)推動(dòng)生物物理新技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。

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This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(30970693,30750009),the Innovation Method Fund of The Ministry of Science and Technology of China(2008IM022000)

Technique and Application of Distance Measurement between Selected Points in Protein Molecule by EPR

WU Ke
Beijing Institute of Radiation Medicine,The Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China

Oct 10,2009 Accepted：Jan 14,2010

WU Ke,Tel：+86(10)66931249,E-mail：wuk315@163.com

The properties and biological functions of protein depend on its structure.Structure determination is strongly dependent on accurate measurement of distance between selected sites in protein.The principle distance measurementby EPR between uncoupled spins was introduced. Furthermore，progress in site-directed spin labeling(SDSL)EPR technique applied in protein structure and function research,was reviewed.

EPR;SDSL;Distance measurement;Protein structure

2009-10-10；接受日期：2010-01-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970693，30750009)，國家科技部創(chuàng)新方法專項(xiàng)課題(2008IM022000)

吳可，電話：(010)66931249，E-mail：wuk315@163.com

Q6-33