鼻咽癌細(xì)胞雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立△

李 萍 張 哲 韋祝新 張錦艷

(1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南寧市 530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧市 530021)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在中國(guó)兩廣地區(qū)高發(fā),60%～70%的患者就診時(shí)已是Ⅲ、Ⅳ期,中晚期患者因較高的局部復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致總生存率偏低[1]。鼻咽癌的臨床標(biāo)本獲取比較有限,這對(duì)開展鼻咽癌生物學(xué)行為的研究極為不利。目前常用的鼻咽癌動(dòng)物模型是裸鼠移植腫瘤模型,該模型實(shí)驗(yàn)條件要求高,且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),費(fèi)用昂貴。雞胚尿囊膜模型是最近開發(fā)的移植瘤模型之一,具有簡(jiǎn)單、方便、價(jià)廉、快速等優(yōu)點(diǎn),國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者把該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于黑色素瘤[2]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[3]、子宮內(nèi)膜腺癌[4]等腫瘤的研究。但用于鼻咽癌研究的尚未見報(bào)道。本課題旨在研究鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)模型的建立,為今后進(jìn)一步開展有關(guān)鼻咽癌的研究創(chuàng)建技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料 鼻咽癌細(xì)胞株 5-8F購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù) 。受精種蛋購(gòu)自南寧市良鳳農(nóng)牧有限責(zé)任公司(原南寧市養(yǎng)雞廠),為良鳳花雞雞種。

1.2 方法 制作雞胚模型的方法:8日齡雞胚在照卵器照射下用鉛筆在蛋殼表面勾畫出氣室、胚體及 CAM上大血管位置;于超凈工作臺(tái)上用轉(zhuǎn)孔器在蛋殼表面“開窗”,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼻咽癌細(xì)胞懸液滴加于CAM,無菌透明輔料封閉方窗;胚蛋放回孵箱繼續(xù)孵育。在此基礎(chǔ)上,分別接種 0.25×106、0.5×106、1×106、2×106個(gè) NPC細(xì)胞及對(duì)照組(IMDM培養(yǎng)基)于雞胚,從孵育 24 h起,每隔 24 h對(duì)胚蛋進(jìn)行原位數(shù)碼攝影。共孵育 120h,分離移植瘤瘤體,測(cè)量其直徑及厚度,計(jì)算腫瘤體積,并行組織切片HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理。兩樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NPC細(xì)胞CAM模型最佳接種條件的確定 根據(jù)雞胚孵化的特點(diǎn),確定最佳的接種時(shí)間為雞胚孵至第 8日齡,終止時(shí)間為雞胚孵至第 14日齡。以“開窗法”為鼻咽癌的最佳接種CAM的方法,以硅膠圈為最佳的接種癌細(xì)胞的載體。按照以上接種條件,我們對(duì)接種NPC細(xì)胞的胚蛋進(jìn)行原位數(shù)碼攝影。從圖1中可以看到,接種 72 h后,在雞胚 CAM膜上已出現(xiàn)了明顯的瘤體,瘤體稍隆起于 CAM膜,邊界清楚,周圍 CAM膜變粗糙,并可見小血管以瘤體為中心放射狀的生長(zhǎng)。對(duì)照組中未見移植瘤生長(zhǎng)。HE染色切片可見,鼻咽癌細(xì)胞以 CAM膜為細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng),形成癌巢;癌細(xì)胞大小不一,核漿比例升高,核染色深,核仁清楚,病理性核分裂像多見(3～8個(gè)/高倍視野),呈明顯的低分化癌的特征(見圖2)。這些均符合鼻咽癌體內(nèi)生長(zhǎng)的模式。

圖1 大體形態(tài)觀察 0.5×106個(gè)鼻咽癌細(xì)胞接種 CAM 72 h移植瘤的生長(zhǎng)

2.2 適宜接種細(xì)胞數(shù)目的確定

2.2.1 確定 NPC細(xì)胞在CAM成瘤的最小接種數(shù)目 以腫瘤直徑達(dá)到或超過 2mm為成瘤陽性。從表1可見,接種細(xì)胞數(shù)為 0.25×106時(shí),雖有移植瘤形成,但成瘤率未達(dá)到 100%;而接種細(xì)胞數(shù)達(dá)到或超過 0.5×106時(shí),成瘤率達(dá)到了 100%。因此,NPC細(xì)胞在 CAM成瘤的最小接種細(xì)胞數(shù)為 0.25×106。

表1 在 CAM上接種不同細(xì)胞數(shù)鼻咽癌細(xì)胞后移植瘤成瘤情況

2.2.2 確定 NPC細(xì)胞在CAM成瘤的適宜接種細(xì)胞數(shù) 從表2及圖3中可以看出,當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)較小時(shí),即 0.25×106和0.5×106,形成的移植瘤體積較小;當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)達(dá)到 1×106時(shí),移植瘤的體積顯著增大(P<0.05)。當(dāng)接種數(shù)量達(dá)到 2×106個(gè)細(xì)胞時(shí),移植瘤體積還有所增大。但同時(shí)移植瘤中心出現(xiàn)明顯的壞死,這一點(diǎn)經(jīng)切片觀察也得到證實(shí)。故鼻咽癌細(xì)胞在 CAM上的適宜成瘤接種細(xì)胞數(shù)是 0.5×106～1×106。

圖2 鼻咽癌細(xì)胞接種 CAM膜組織HE切片觀察(HE 40×10)

表2 CAM上接種不同細(xì)胞數(shù)鼻咽癌細(xì)胞 120 h移植瘤體積

圖3 CAM上接種不同細(xì)胞數(shù)鼻咽癌細(xì)胞 120 h后移植瘤瘤體觀察

3 討 論

近代,雞胚材料在多個(gè)研究領(lǐng)域和方向被大量的應(yīng)用,主要原因是雞胚的免疫力低,適合異種細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,雞胚具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要特殊設(shè)備的特點(diǎn),因此在一般實(shí)驗(yàn)室即可開展。目前雞胚已經(jīng)普遍應(yīng)用于發(fā)育學(xué)[5]、病毒學(xué)[6]、寄生蟲學(xué)(如原蟲[7]),以及一些腫瘤和非腫瘤性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥[8])的研究中。而在所有應(yīng)用雞胚材料的實(shí)驗(yàn)中,CAM在腫瘤學(xué)方面的研究,是其中的一個(gè)熱點(diǎn)。

雞胚的發(fā)育期是 20～21 d,在雞胚尿囊發(fā)育過程中,尿囊體壁中胚層與絨毛膜臟壁中胚層融合形成絨毛尿囊膜 CAM。絨毛尿囊膜與外方的多孔外殼緊貼的特點(diǎn)以及其中豐富的毛細(xì)血管叢,保證了最高水平的氣體和營(yíng)養(yǎng)交換,這使得絨毛尿囊膜成為雞胚的重要呼吸器官。同時(shí)也因這一特點(diǎn)使它能有效地支持組織移植物的生長(zhǎng),這些均使雞胚絨毛尿囊膜成為研究腫瘤的良好動(dòng)物模型。

為了建立好鼻咽癌雞胚絨毛尿囊膜模型,我們對(duì)模型制作手法和接種條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先是制作方法的選擇,常用的建立雞胚尿囊膜模型的方法有兩種:無殼法和窗法。無殼法是 Auerbach教授于1974年創(chuàng)立的[9],國(guó)外許多學(xué)者提倡使用此方法,認(rèn)為它易于動(dòng)態(tài)觀察。我們發(fā)現(xiàn)無殼法培養(yǎng)雞胚死亡率較高,且在南方的潮濕環(huán)境下雞胚易于感染。而窗法有相對(duì)易于操作、成瘤率高等優(yōu)點(diǎn),因此確立了使用窗法作為模型建立的方法。經(jīng)過反復(fù)摸索,我們掌握了給雞胚“開窗”的最佳方法,使雞胚“開窗”成功率接近 100%。其次在載體的選擇方面,由于在已建立的各種腫瘤雞胚 CAM模型中,對(duì)于載體的使用沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),我們嘗試了文獻(xiàn)報(bào)道的多種載體,包括甲基纖維素膜、明膠海綿、硅膠圈和無載體細(xì)胞懸液直接滴注等方法。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)摸索,我們認(rèn)為對(duì)于一定量?jī)?nèi)的癌細(xì)胞接種,以硅膠圈法最為理想,其可通過限定一定的接種表面積及體積保證實(shí)驗(yàn)的同一性。然而對(duì)于活檢的原代組織的接種,直接接種是較好的方法。在接種時(shí)間的選擇上,由于雞胚發(fā)育的特點(diǎn)是:在孵育的第 6天,尿囊急劇增大與漿膜相貼愈合,形成尿囊絨毛膜;至孵育的第 8天,尿囊較第 7天擴(kuò)大了一倍,幾乎包圍了卵黃囊。因此我們選擇的接種時(shí)間是雞胚孵至 8日齡時(shí)。根據(jù)雞胚免疫器官發(fā)育的特點(diǎn):孵化到第 2周時(shí),雞胚胸腺中的淋巴細(xì)胞就可出現(xiàn)宿主抗移植物反應(yīng)[10],故此我們選擇的實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間是最遲至雞胚孵育的第 14日齡。經(jīng)過對(duì)實(shí)驗(yàn)手法的摸索,我們接種鼻咽癌細(xì)胞于 CAM膜上,成功地使之在CAM上形成移植瘤。通過原位攝影,我們觀察了移植瘤出現(xiàn)、形成和發(fā)展的過程。顯微鏡下,癌細(xì)胞侵襲浸潤(rùn) CAM膜;CAM膜內(nèi)的癌細(xì)胞排列方式恢復(fù)為與人體內(nèi)一致的巢狀結(jié)構(gòu),同時(shí)癌細(xì)胞保持低分化癌的形態(tài),充分說明鼻咽癌CAM移植瘤可模擬鼻咽癌人體內(nèi)生長(zhǎng)模式。

除了對(duì)以上條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化,我們進(jìn)一步還要優(yōu)化癌細(xì)胞的接種數(shù),以確保成瘤率及腫瘤的有效生長(zhǎng)。不同的腫瘤細(xì)胞 CAM膜移植成瘤能力不同。有資料表明,前列腺癌細(xì)胞株[11]、黑色素瘤細(xì)胞株[12]接種細(xì)胞數(shù)在 105～106之間就可有較好的腫瘤組織形成能力。而卵巢癌細(xì)胞須在細(xì)胞數(shù)達(dá)到 107～108時(shí)才能形成移植瘤[13]。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種鼻咽癌細(xì)胞數(shù)在 0.25×106時(shí)雖可成瘤,但成瘤率未達(dá) 100%;當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)在 0.5×106及以上時(shí),成瘤率方達(dá) 100%。此外,接種 0.25×106個(gè)鼻咽癌細(xì)胞時(shí),形成的移植瘤體積較小。隨著接種細(xì)胞數(shù)目的增加,形成移植瘤的體積有所增大。能引起移植瘤體積顯著增加的接種細(xì)胞數(shù)為 1×106。而當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)增加至 2×106時(shí)移植瘤中心出現(xiàn)明顯壞死。從以上結(jié)果可以看出,人鼻咽癌細(xì)胞株的適宜接種細(xì)胞數(shù)為 0.5～1×106個(gè)細(xì)胞/只雞胚。

我們摸索出了建立鼻咽癌細(xì)胞CAM移植瘤的成熟條件,成功地建立了鼻咽癌CAM移植瘤模型,為開展鼻咽癌的生物學(xué)行為研究奠定了又一個(gè)技術(shù)平臺(tái),對(duì)防治鼻咽癌的工作具有重要意義。

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