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    肝素鈉對肢體缺血/再灌注損傷大鼠腸系膜微循環(huán)的保護(hù)作用*

    2010-08-30 07:33:12孔小燕宓士軍董淑云王銀環(huán)門秀麗張連元
    關(guān)鍵詞:管徑腸系膜肝素

    孔小燕,宓士軍,趙 霞,董淑云,王銀環(huán),張 娜,門秀麗,張連元

    (1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,唐山 063000;2.唐山市豐潤區(qū)醫(yī)院骨科,唐山 064000)

    肢體缺血/再灌注損傷在臨床是一種常見的損傷,本實驗室多年來以結(jié)扎大鼠后肢阻斷血流數(shù)小時再給予松解恢復(fù)血供為方法,制作典型的肢體缺血/再灌注損傷模型,模擬臨床斷肢再植手術(shù)后、嚴(yán)重肢體擠壓傷或四肢大血管血栓形成再通治療后等情況,系統(tǒng)研究了再灌注損傷時遠(yuǎn)隔器官的損傷機(jī)制。本實驗擬從再灌注時全身微循環(huán)的改變角度探討遠(yuǎn)隔器官損傷的發(fā)生機(jī)制,并同時觀察肝素對再灌注時微循環(huán)的影響,以期為臨床治療肢體缺血/再灌注損傷提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康雄性Wistar大鼠20只,體重(240±10)g,由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

    1.2 模型制作及分組

    大鼠LI/R模型應(yīng)用本實驗室常規(guī)方法[1,2],將大鼠雙后肢根部用止血帶結(jié)扎,完全阻斷血流,4 h后松解止血帶,恢復(fù)雙后肢血流,肝素組(H組)于松解止血帶前30 min于陰莖靜脈內(nèi)注射肝素1 000 U/kg(1 ml/kg),缺血/再灌注組(I/R組)于相同時間注射等量生理鹽水,兩組動物均于再灌注2 h時自腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉,然后沿大鼠右側(cè)腹部做一縱形切口,打開腹腔,輕輕拉出回盲部腸袢,固定于微循環(huán)顯微鏡載物臺的恒溫灌流盒上,顯微鏡與BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)連接,用以觀察和記錄小腸微循環(huán)變化。10 min從腹主動脈取血處死動物。

    1.3 腸系膜微循環(huán)觀測指標(biāo)

    腸系膜微動脈血流速度(arteriole flow velocity,AFV)和微靜脈血流速度(venule flow velocity,VFV),微動脈管徑(microvascular arteriole diameter,AD)和微靜脈管徑(microvascular venule diameter,VD)。

    1.4 血流變觀測指標(biāo)

    血漿黏度(plasma viscosity,ηp)、全血低切還原黏度(low shear reduction viscosity,Lηre)、全血高切還原黏度(high shear reduction viscosity,Hηre)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit,Hct)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(erythrocyte aggregation index,EAI)、血沉方程K值(erythrocyte sedimentation rate K,ESRK)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)(erythrocyte rigidity index,TK),紅細(xì)胞變形指數(shù)(erythrocyte deformability index,EDI),應(yīng)用SA-6000全自動血流變檢測儀(北京賽科希德公司)檢測以上指標(biāo)。

    1.5 血清中 P-選擇素和ICAM-1的檢測

    實驗結(jié)束前從大鼠腹主動脈取血5 ml,置于EDTA抗凝試管中迅速離心取上清液于-20℃冰箱中凍存。采用ELISA方法檢測血清中P-選擇素和ICAM-1的含量,ELISA試劑盒購自天津灝洋生物制劑公司,操作嚴(yán)格按照說明書步驟,在美國Bio-rad 550型酶標(biāo)儀上讀取結(jié)果。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    2結(jié)果

    2.1 腸系膜微循環(huán)觀測情況

    大鼠LI/R后腸系膜微循環(huán)較正常大鼠有特征性改變[5],主要表現(xiàn)為腸系膜微動、靜脈管徑擴(kuò)張,血流速度減慢,微血管中大量白細(xì)胞貼壁、粘附,白微栓形成增多,部分毛細(xì)血管閉塞、血流停滯,伴管周出血現(xiàn)象。肝素組腸系膜微動脈管徑(AD)靜脈管徑(VD)較單純?nèi)毖?再灌注損傷組明顯減小(P<0.01),而微動脈血流速度(AFV)和微靜脈血流速度(VFV)較對照組明顯增快(P<0.01,表1)。

    2.2 血流變各項指標(biāo)

    肝素組血漿黏度(η p)、全血低切還原黏度(L η re)、全血高切還原黏度(Hη re)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit,Hct)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(EAI)、血沉方程K值(ESRK)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)(TK)較單純?nèi)毖?再灌注損傷組明顯下降(P<0.01),而紅細(xì)胞變形指數(shù)(EDI)增加(P<0.01,表2)。

    2.3 血清中 P-選擇素和ICAM-1的水平

    肝素組P-選擇素和ICAM-1的含量均明顯低于單純?nèi)毖?再灌注組(P<0.01,表3)。

    Tab.1 Changes of mesenteric microcirculation in different groups(±s,n=10)

    Tab.1 Changes of mesenteric microcirculation in different groups(±s,n=10)

    AD:Microvascular arteriole diameter;VD:Microvascular venule diameter;AFV:Arteriole flow velocity;VFV:Venule flow velocity;H:Heparin;I/R:Ischemia/reperfusion**P<0.01 vs H group

    Group AD(μ m) VD(μ m) AFV(μ m/s) VFV(μ m/s)H 14.85±0.48 18.80±1.01 1516.10±83.33** 1320.40±83.41**I/R 16.27±0.63** 21.07±1.21** 992.15±84.95** 784.36±84.45**

    Tab.2 Changes of mesenteric hemorheology in different groups(±s,n=10)

    Tab.2 Changes of mesenteric hemorheology in different groups(±s,n=10)

    η p:Plasma viscosity;L η re:Low shear reduction viscosity;Hη re:High shear reduction viscosity;Hct:Hematocrit;EAI:Erythrocyte aggregation index;ESR K:Erythrocyte sedimentation rate K;TK:Erythrocyte rigidity index;EDI:Erythrocyte deformability index**P<0.01 vs H group

    G η p(mPa.s) Lη re(mPa.s)Hη re(mPa.s) Hct(L/L) EAI ESRK TK EDI H 1.23±0.19 42.62±0.614.70±0.18 0.45±0.03 5.61±0.22 3.92±0.14 3.75±0.14 0.68±0.01 I/R 1.35±0.03**44.46±0.44**6.13±0.12**0.58±0.02**6.13±0.14**4.50±0.42**4.75±0.31**0.60±0.01**

    Tab.3 Changes of plasma P-selectin and ICAM-1 in different groups(pg/ml,±s,n=10)

    Tab.3 Changes of plasma P-selectin and ICAM-1 in different groups(pg/ml,±s,n=10)

    **P<0.01 vs H group

    Group P-selectin ICAM-1 H 2031.51±122.63 1077.89±47.36 I/R 1876.30±119.95** 1362.26±94.22**

    3 討論

    缺血組織再灌注后引發(fā)一系列復(fù)雜的反應(yīng)使組織細(xì)胞損傷持續(xù)存在并加重,甚至引發(fā)多器官功能衰竭,其機(jī)制尚未完全闡明,除了已經(jīng)公認(rèn)的活性氧、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞爆發(fā)以外,近年研究也表明IRI時微循環(huán)功能的惡化是導(dǎo)致全身多器官功能損傷的基礎(chǔ)之一,而微循環(huán)功能的惡化又與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[3]、白細(xì)胞的介導(dǎo)損傷[4]、炎癥介質(zhì)和粘附因子增多及血液流變學(xué)的改變密切相關(guān)[5]。腸系膜微循環(huán)是全身微循環(huán)變化的一個窗口,因其便于觀測而成為了解全身微循環(huán)變化的一種手段。LI/R時腸系膜微循環(huán)有特征性改變,主要表現(xiàn)為LI/R初期腸系膜微動、靜脈管徑減小,隨著缺血肢體再灌注時間的延長,逐漸出現(xiàn)血管擴(kuò)張和血流速度減慢,同時白細(xì)胞邊集的現(xiàn)象越來越明顯,并逐漸發(fā)生白細(xì)胞滾動和貼壁,甚至可以見到血小板栓子的形成,LI/R后期腸系膜微動、靜脈管腔嚴(yán)重擴(kuò)張,血流速度減慢,微血管中大量白細(xì)胞貼壁、粘附,白微栓形成增多,局部區(qū)域可見微血管破裂、血細(xì)胞溢出。當(dāng)再灌注200 min后,部分毛細(xì)血管閉塞、血流停滯,管周出血現(xiàn)象加重[5]。

    P-選擇素與ICAM-1是血管黏附分子家族中的重要成員,在LI/R過程中可以介導(dǎo)白細(xì)胞黏附、浸潤、滲出和釋放炎癥介質(zhì),從而導(dǎo)致微循環(huán)功能的惡化,進(jìn)而引起器官功能的損傷。

    肝素是一種臨床常用抗凝藥物,主要通過與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)結(jié)合,而增強(qiáng)后者對活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破壞,妨礙凝血激活酶的形成;阻止凝血酶原變?yōu)槟?抑制凝血酶,從而妨礙纖維蛋白原變成纖維蛋白。有研究報導(dǎo)肝素可以通過保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞而改善內(nèi)毒素血癥大鼠微循環(huán)的功能而減輕器官功能的損傷[3];也有研究顯示肝素還可以通過降低血漿中D-二聚體水平改善缺血/再灌注損傷胰腺的微循環(huán)功能。

    本實驗觀察到肝素在肢體缺血/再灌注損傷時可以明顯降低血清P-選擇素和ICAM-1的水平,改善血液流變性狀,使腸系膜微循環(huán)功能改善。但是早期應(yīng)用肝素是否可以減輕全身器官的損傷,提高LI/R后的生存率尚需進(jìn)一步的觀察。

    [1]楊秀紅,張連元,孫樹勛,等.一氧化氮在大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷中的作用[J].生理學(xué)報,2002,54(3):234-238.

    [2]門秀麗,張連元,宋立川,等.肢體缺血再灌注后紅細(xì)胞變形能力的改變及其缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用[J].中國病理生理雜志,2001,17(12):1178-1211.

    [3]Iba T,Takayama T.Enoxaparin attenuates endothelial damage with less bleeding compared with unfractionated heparin in endotoxemic rats[J].Shock,2009,32(5):530-534.

    [4]Qi F,Adair A,Ferenbach D.Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation[J].Transplantation,2008,86(9):1267-1274.

    [5]趙 霞,張 娜,王銀環(huán),等.肢體缺血再灌注損傷對大鼠腸系膜微循環(huán)和血液流變性的變化及意義[J].中國微循環(huán),2008,12(4):215-218.

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