家蠶基因組P450基因家族的分析

周 權(quán),王寶玉

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)院,安徽合肥 230036;2.阜陽(yáng)師范學(xué)院附屬中學(xué),安徽阜陽(yáng) 236041)

家蠶基因組P450基因家族的分析

周 權(quán)1,王寶玉2

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)院,安徽合肥 230036;2.阜陽(yáng)師范學(xué)院附屬中學(xué),安徽阜陽(yáng) 236041)

利用家蠶基因組mRNA和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)P450基因進(jìn)行搜索,結(jié)果顯示:在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)77個(gè)P450基因,分別歸于18個(gè)P450家族和26個(gè)亞家族,其中有9個(gè)多基因家族,3個(gè)基因家族的成員超過(guò)10個(gè),CYP4有20個(gè)成員,是一個(gè)典型的多基因家族。對(duì)P450基因進(jìn)行正選擇、基因轉(zhuǎn)換和基序分析,結(jié)果表明:1個(gè)組(包含3個(gè)P450s基因)中檢測(cè)出了顯著的正選擇替換位點(diǎn),在這1個(gè)組中,轉(zhuǎn)換事件的次數(shù)為3次。

家蠶;細(xì)胞色素P450;正選擇;基因轉(zhuǎn)換

細(xì)胞色素P450加單氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,P450s)是一類(lèi)由超基因家族編碼的含血紅素和巰基的結(jié)合蛋白[1]。P450的重要特征是還原型細(xì)胞色素P450與CO結(jié)合形成的復(fù)合物,在波長(zhǎng)450nm處有最大的特征性吸收峰(γ峰),細(xì)胞色素P450命名正是由來(lái)于此。P450的系統(tǒng)命名是根據(jù)氨基酸序列的相似程度作為劃分P450家族與亞家族的依據(jù),并用數(shù)字和字母分別代表P450家族與亞家族的名字,同源性超過(guò)40%的為同一家族的基因成員,而同源性超過(guò)55%以上,則為同一亞族成員。P450廣泛分布于各種生物中,參與許多外源物質(zhì)(如殺蟲(chóng)劑、環(huán)境有毒物質(zhì))和內(nèi)源物質(zhì)(如激素、脂肪酸)的代謝,是重要的代謝酶系[2],如昆蟲(chóng)的CYP6和CYP9及甲殼動(dòng)物的CYP2都具有抗植物毒素的功能,果蠅的CYP18和東亞飛蝗CYP6H1分別參與蛻皮類(lèi)固醇激素的代謝和活化。

家蠶(Bombyx mori)屬鱗翅目蠶蛾科,普遍存在,廣大桑農(nóng)普遍飼養(yǎng),是生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)研究較為理想的模式生物。家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)于2003年由中國(guó)科學(xué)家率先公布,為研究家蠶中P450基因家族提供了條件。本文通過(guò)對(duì)家蠶全基因組P450基因種類(lèi)的鑒定、正選擇方式和基因間序列重組和交換的評(píng)估來(lái)研究P450基因家族的進(jìn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 全基因組P450基因的鑒定

以家蠶為研究對(duì)象,基因組序列與基因序列來(lái)自于silkworm genome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.genomics.org.cn/,下載時(shí)間2009年3月)。家蠶全基因組中P450首先用P450的HMM(Hidden Markov model)序列在本地家蠶 mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TblastN(E value threshold>0.01)搜索,得到所有可能是P450類(lèi)型基因的序列;再到相應(yīng)的氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)尋找相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,然后將這些基因序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別通過(guò) Pfam程序檢驗(yàn)其是否含有 P450結(jié)構(gòu)域。對(duì)所獲得的 P450基因在 http://www.cyped.uni-stuttgart.de/中,E-value小于等于1e-7的情況下作BLASTP比對(duì),進(jìn)行基因家族和亞家族的命名。

1.2 P450基因的分組

利用MEGA4.0對(duì)所有序列進(jìn)行距離法(Neighbor -Joining method)系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建,對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)化枝中的基因根據(jù)氨基酸相似度大于60%的標(biāo)準(zhǔn)分組。

1.3 P450基因正選擇和基因轉(zhuǎn)換分析

本文ω的計(jì)算使用PAML軟件包中的codeml程序,分別在不同的密碼子替代模型M7和M8下進(jìn)行計(jì)算,這兩種模型的適合度通過(guò)likelihood ratio(LR)統(tǒng)計(jì)方法來(lái)檢驗(yàn)。正選擇的氨基酸位點(diǎn)通過(guò)PAML中的Bayesian方法計(jì)算得到。組內(nèi)基因間的序列交換檢驗(yàn)采用 GENECONV1.81程序默認(rèn)參數(shù)來(lái)完成。P< 0.05為具有統(tǒng)計(jì)意義的基因交換事件。

2 結(jié)果分析

2.1 家蠶P450的基因的種類(lèi)和分組

對(duì)家蠶mRNA分析結(jié)果表明:家蠶基因組含有P450基因77條。根據(jù)它們的氨基酸序列相似程度劃分而歸屬于18基因家族和26亞家族,其中有9個(gè)多基因家族,3個(gè)基因家族的成員超過(guò)10個(gè),CYP4有20個(gè)成員,占家蠶P450基因的26.0%。

圖1 家蠶P450基因的系統(tǒng)樹(shù)

并利用MEGA4.0對(duì)家蠶基因組77條P450基因編碼區(qū)的核苷酸序列排序,按距離法構(gòu)建了系統(tǒng)樹(shù)(圖1),反映了77條P450基因之間的進(jìn)化關(guān)系。為更好地分析基因正選擇和基因轉(zhuǎn)換,我們對(duì)其進(jìn)行了分組,分組標(biāo)準(zhǔn)為系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)化枝中基因的氨基酸相似度大于60%。結(jié)果顯示:家蠶77條 P450基因中的44條序列可歸入12個(gè)組,而其余的9條基因序列因差異太大而不能被歸入任何一組。在這12組中,由于正選擇位點(diǎn)的 PAML分析以及基因轉(zhuǎn)換的 GENECONV要求最少有3條序列,因此,最終用于正選擇和基因轉(zhuǎn)換分析的序列共3組,包含11條序列。

2.2 家蠶P450正選擇、基因轉(zhuǎn)換及其相互關(guān)系

對(duì)P450基因3個(gè)組中的11條基因進(jìn)行正選擇位點(diǎn)的分析,同時(shí)滿(mǎn)足下列兩個(gè)條件即判斷為顯著的正選擇:(1)對(duì)于M7-M8的LR檢驗(yàn),其結(jié)果2Δl的顯著程度根據(jù)其相對(duì)于χ2(d.f.=1)的分布值進(jìn)行判斷,即當(dāng)2Δl>3.84時(shí),P<0.05,顯示為顯著;2Δl>10.83時(shí),P<0.001,顯示為極顯著;(2)M8計(jì)算結(jié)果中ω> 1.0。結(jié)果顯示(表1):1個(gè)組,包含3條基因,符合上述條件,說(shuō)明這些基因可能受到正選擇壓力作用。其中1個(gè)組,包含3條基因,利用M8中Bayesian方法檢驗(yàn)出14個(gè)概率大于95%的正選擇氨基酸位點(diǎn)。

在11條 P450基因構(gòu)成的3個(gè)組中,有1個(gè)組(包含4個(gè)基因)檢測(cè)出了統(tǒng)計(jì)上具有顯著意義的基因轉(zhuǎn)換事件(表2)。在 P450基因3個(gè)組中,檢測(cè)出顯著正選擇位點(diǎn)的基因共3個(gè);檢測(cè)出參與基因轉(zhuǎn)換的基因2個(gè);既沒(méi)有檢測(cè)出正選擇位點(diǎn),又沒(méi)有檢測(cè)出基因轉(zhuǎn)換的基因6個(gè)(表2)。

表1 LR檢驗(yàn)結(jié)果

表2 P450基因的正選擇和基因轉(zhuǎn)換的分析

表2中黑體序號(hào)代表處于正選擇壓力的組;黑體基因序列名稱(chēng)代表參與基因轉(zhuǎn)換的基因。

3 討論

與果蠅(86個(gè)P450基因)和按蚊(105個(gè)P450基因)等昆蟲(chóng)的P450家族相比[3],家蠶該基因家族的數(shù)量少于上述昆蟲(chóng)。在果蠅和按蚊等昆蟲(chóng)中P450含有較多的CYP4和CYP6家族,而家蠶P450含有較多的CYP4、CYP6和CYP9家族。其中CYP4家族基因可能與氣味分子代謝有關(guān),使嗅覺(jué)組織免受傷害,同時(shí)也有報(bào)道它們可能與氣味識(shí)別有關(guān)。CYP6A與外源性毒物代謝有關(guān),CYP6B主要是被植物毒素所誘導(dǎo)[4,5],同時(shí)也被植物信號(hào)分子所激活。這也許是由于不同昆蟲(chóng)的生活環(huán)境和習(xí)性不同所致,從而使它們的代謝途徑和抗外源化合物機(jī)制不同。

研究表明,在表面受體蛋白、寄主防御系統(tǒng)(如人類(lèi)的MHC)、植物NBS-LRR和哺乳動(dòng)物的P450基因中,正選擇作用都普遍存在[6]。我們使用 PAML程序?qū)450基因家族11條序列進(jìn)行正選擇分析,其中3條P450基因序列中含有顯著性的正選擇位點(diǎn)。Healther等(2006)研究發(fā)現(xiàn)CYP1A亞家族基因旁系同源(paralog)存在正選擇現(xiàn)象,正選擇區(qū)域主要位于底物結(jié)合位點(diǎn)SSR3、SSR4和酶催化有關(guān)的位點(diǎn)Helix I。da Fonseca(2007)研究顯示哺乳動(dòng)物 P450基因的正選擇位點(diǎn)也主要存在于底物結(jié)合位點(diǎn)(SSR)?？梢?jiàn),底物結(jié)合位點(diǎn)和酶催化相關(guān)位點(diǎn)的正選擇有利于P450根據(jù)環(huán)境中多樣的內(nèi)源和外源化合物來(lái)拓寬和改變底物的專(zhuān)化性。家蠶P450基因的正選擇位點(diǎn)是否也存在于底物結(jié)合區(qū)有待于研究。

因?yàn)镚ENECONV程序不能?chē)?yán)格區(qū)分不等價(jià)交換與經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)換,我們所研究的基因轉(zhuǎn)換其實(shí)包含了經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)換和基因間的不等價(jià)交換兩層含義,這在多基因家族的進(jìn)化中起著重要的作用。家蠶P450基因家族3個(gè)基因組中,有1個(gè)組(包含2個(gè)基因)檢測(cè)出了具有統(tǒng)計(jì)上顯著意義的基因轉(zhuǎn)換事件?；蜣D(zhuǎn)換事件發(fā)生頻繁的基因更容易受正選擇作用的原因可能是,頻繁發(fā)生基因轉(zhuǎn)換的基因更容易受到正選擇而得以保存,當(dāng)然,受正選擇壓力的基因不僅只有基因轉(zhuǎn)換這一種突變方式,點(diǎn)突變等其它突變方式也可能被選擇保存。

[1]DoddapaneniH,ChakrabortyR,YadavJS.Genome-wide Structural and Evolutionary Analysis of the P450 Monooxy Genase Genes(P450ome)in the White Rot Fungus Phanerochaete Chrysosporium:Evidence for Gene Duplications and Extensive Gene Clustering[J].BMC Genomics, 2005,6:92-116.

[2]Li L,Cheng H,Gai J et al.Genome-wide IdentiWcation and Characterization of Putative Cytochrome P450 Genes in the Model Legume Medicago Truncatula[J].Planta, 2007,226:109-123.

[3]Poupardin R,Reynaud S,Strode C et al.Genomic Analysis of Detoxification Genes in the Mosquito Aedes Aegypti [J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2008,38 (1):113-123.

[4]Wen,Z.M.,Berenbaum,M.R.,and Schuler,M.A.Inhibition of CYP6B1-mediated Detoxification of Xanthotoxin by Plant Allelochemical in the Black Swallow (Papilio polyxenes)[J].Journal of Chemical Ecology,2006,32(3): 507-522.

[5]Grubor,V.D.,and Heckel,D.G.Evaluation of the Role of CYP6B Cytochrome P450s in Pyrethroid Resistant Australian Helicoverpa Armigera[J].Insect Molecular Biology,2007,16(1):15-23.

[6]季軍,楊四海,田大成.水稻基因組中抗病基因正選擇方式及基因轉(zhuǎn)換的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(9):1856 -1863.

A Genome-wide Analysis of P450 Gene Family in Silkworm

ZHOU Quan1,WAN G Bao-yu2
(1.Graduate School,A nhui A gricultural University,Hef ei230036,China;
2.The A f f iliated Middle School,Fuyang Teachers College,Fuyang230062,China)

A genome-wide analysis of P450 genes were performed in silkworm genome based on their mRNA and amino acid data.77 P450 genes,assigned into 18 gene families and 26 subfamilies,were identified,it contains 9 multi-gene family,3 gene family has more than 10 members in it.CYP4 have 20 members,is a typical multi-gene family.P450 genes of silkworm positive selection,gene conversion and base sequence analysis,results showed that:A group(including three P450s genes)detected significant site is to choose the replacement,in this one group,the number of conversion events 3 times.

silkworm;cytochrome P450;positive selection;gene conversion

Q969.9

A

1009-9735(2010)05-0074-03

2010-08-06

周權(quán)(1976-),男,安徽肥東人,助理研究員,在讀博士生,研究方向:分子生物學(xué)。