芪棱湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質(zhì)金屬白酶－3表達(dá)的影響＊

周榮峰

芪棱湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質(zhì)金屬白酶－3表達(dá)的影響＊

周榮峰

目的觀察芪棱湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質(zhì)金屬蛋白酶－3(MMP－3)表達(dá)的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組(對(duì)照組)及芪棱湯組(治療組)。采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法復(fù)制大鼠腦缺血再灌注(MCAO/Reperfusion)模型。通過(guò)測(cè)定滲出血管外的伊藍(lán)(EB)含量來(lái)評(píng)價(jià)血腦屏障通透性的變化，在再灌注不同時(shí)點(diǎn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP－3的表達(dá)。結(jié)果在再灌注各時(shí)間點(diǎn)，治療組、對(duì)照組與模型組比較均有顯著差異，治療組、對(duì)照組EB滲出量、MMP－3表達(dá)少于模型組;治療組與對(duì)照組有顯著差異，治療組EB滲出量、MMP－3表達(dá)少于對(duì)照組。結(jié)論芪棱湯對(duì)腦缺血再灌注后的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制MMP－3表達(dá)保護(hù)血腦屏障有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷 芪棱湯 血腦屏障 基質(zhì)金屬蛋白酶－3

廣東省深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院(深圳518108)

＊廣東省深圳市科技計(jì)劃非資助項(xiàng)目(No.200903189)

缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過(guò)程，血腦屏障的完整性在腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程中起著重要的作用。缺血后再灌注將導(dǎo)致血腦屏障嚴(yán)重破壞，從而促發(fā)明顯的腦水腫和梗死。大量研究證實(shí)，蛋白酶是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的主要因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察芪棱湯對(duì)腦局灶性缺血再灌注后血腦屏障通透性的變化和基質(zhì)屬蛋白酶－3(MMP－3)表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明芪棱湯抗腦缺血再灌注損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物:SD雄性大鼠126只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(300±30)g，月齡4個(gè)月左右。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):2007A010。試藥:芪棱湯精制液(黃芪、桑椹、天花粉、三棱、莪術(shù)、枳殼、豨薟草、水蛭)，芪棱湯去養(yǎng)陰藥精制液，均由深圳市人民醫(yī)院制劑中心提供;伊藍(lán)(EB)、MMP一3兔多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組 126只SD大鼠隨機(jī)分為芪棱湯組(治療組)、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組(對(duì)照組)、模型組，每組40只，假手術(shù)組6只，前3 組每組又分為缺血 3h 再灌注 6、12h、1、3、7d 5 個(gè)亞組，各亞組每組8只。

1.3 給藥 各組在實(shí)驗(yàn)前7d灌胃相應(yīng)藥物，治療組灌服芪棱精制液，對(duì)照組給予芪棱湯去養(yǎng)陰藥精制液，每次20mL/kg，其余兩組予等劑量生理鹽水。每12小時(shí)給藥1次，每日2次，直至處死。采用盲法給藥，給藥由專人負(fù)責(zé)，造模者回避。

1.4 造模方法 造模方法采用在Zea longa[1]基礎(chǔ)上改良的頸內(nèi)動(dòng)脈線栓加環(huán)扎法。

1.5 血腦屏障通透性評(píng)價(jià) 各組大鼠均在處死前30min通過(guò)尾靜脈注射2%EB 2mL/kg，用甲酰胺浸泡法[2]測(cè)量腦組織中的EB含量。建立EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各標(biāo)準(zhǔn)管相應(yīng)的光密度值(X)與EB含量(Y)的直線回歸方程:Y=11.33 X－0.347。取缺血灶周圍約0.4g腦組織標(biāo)本，稱取質(zhì)量后放人盛有4mL甲酰胺的試管中，加上橡皮塞，45℃水浴24h，加溫?cái)?shù)小時(shí)后用一根細(xì)棒將浮在上面的腦組織輕輕加壓后使其下沉，使腦組織中EB能充分溶解出來(lái)。水浴24h后用吸管輕輕吸出上清液，然后比色測(cè)光密度值。腦組織EB含量(μg/g)=A×甲酰胺量(mL)/腦濕質(zhì)量(g)，A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得的樣本EB含量，單位為μg/mL。

1.6 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MMP－3表達(dá) 各組在再灌注的各時(shí)間點(diǎn)取動(dòng)物，斷頭處死，以視交叉為中線取約4mm厚的腦組織，平分切成2mm厚的腦片，置于4%多聚甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚4μm。。切片收集于0.01mol/L PBS液內(nèi)，用多克隆兔抗MMP－3抗體，采用漂浮法對(duì)其進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。MMP－3陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)染色，陽(yáng)性染色為棕黃色，正常細(xì)胞呈綠色。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織EB滲出量 見(jiàn)表1。假手術(shù)組可見(jiàn)極少量EB滲出。模型組在再灌注6h腦組織EB滲出量增加，可見(jiàn)損傷區(qū)藍(lán)染較正常區(qū)域顏色深，再灌12h腦組織EB滲出量逐漸增加，再灌注1d腦組織EB滲出量達(dá)到高峰，再灌注3d以后逐漸減小。對(duì)照組、治療組與模型組表達(dá)規(guī)律一致。在再灌注6、12h、1、3、7d，治療組、對(duì)照組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，治療組、對(duì)照組EB滲出量少于模型組(P ＜0.01);治療組EB滲出量少于對(duì)照組(P ＜0.01)。

表1 各組再灌注各時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量變化 (μg/g，±s)

與模型組比較，＊P ＜0.01;與對(duì)照組比較，△P ＜0.01。下同

組別假手術(shù)組模型組對(duì)照組治療組6h 0.20 ± 1.04 1.62 ± 1.04 0.92 ±2.63＊0.38 ±0.99＊△12h－2.15 ±0.57 1.31 ±1.31＊0.81 ±1.38＊△1d－3.13 ±1.53 2.32±1.76＊1.46 ± 0.08＊△3d－2.56 ±1.81 1.73 ±2.01＊0.83 ±1.17＊△7d－1.65 ±0.57 0.91 ±1.33＊0.26 ±1.82＊△

2.2 各組MMP－3表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 見(jiàn)表2。MMP－3在小膠質(zhì)細(xì)胞、缺血神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中表達(dá)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)淡棕黃色。假手術(shù)組可見(jiàn)微弱MMP－3表達(dá)。模型組再灌注6h即有表達(dá)，1d明顯增多，3d達(dá)到高峰，以后逐漸下降。對(duì)照組、治療組與模型組表達(dá)規(guī)律一致。再灌注 6、12h、1、3、7d，治療組、對(duì)照組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，治療組、對(duì)照組MMP－3表達(dá)少于模型組 (P＜0.01);治療組MMP－3表達(dá)少于對(duì)照組(P ＜0.01)。

3 討論

缺血性腦梗死屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，歷代醫(yī)家對(duì)中風(fēng)有不同的看法，提出了許多不同的治療方法。自清代王清任提出“氣虛血瘀”理論，將補(bǔ)氣藥及活血化瘀并用，創(chuàng)補(bǔ)陽(yáng)還五湯后，中醫(yī)學(xué)對(duì)缺血性腦梗死的治療多從“氣虛血瘀”角度出發(fā)采用益氣活血法。而對(duì)“津血同源”、“陰虛致瘀”的理論認(rèn)識(shí)運(yùn)用不足。本課題在“津血同源”、“陰虛致瘀”等理論的基礎(chǔ)上，給合多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出了“氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)”是缺血性腦梗死的又一重要病機(jī)，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)“增水行舟”的理論[3]，創(chuàng)立益氣養(yǎng)陰活血方劑芪棱湯。本方重用黃芪大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，令氣旺血行，瘀去絡(luò)通，為君藥;桑葚、天花粉滋陰生津，增液以行舟，令氣行血運(yùn)為臣藥;三棱、莪術(shù)、枳殼、豨薟草活血祛瘀，水蛭通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。本方配伍特點(diǎn)為大量補(bǔ)氣藥與滋陰藥相配，并佐以少量活血藥，共起補(bǔ)氣養(yǎng)陰活血之功。芪棱湯用于臨床治療腦梗死等缺血性腦血管病，取得令人滿意的療效[4－6]。

神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互依存關(guān)系是組成和維持腦功能及結(jié)構(gòu)的必要條件，血腦屏障參與血腦物質(zhì)交換的調(diào)節(jié)，而神經(jīng)元的直接生存微環(huán)境是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間的細(xì)胞間液，即細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)[7]。腦組織中ECM是維持血腦屏障結(jié)構(gòu)完整性的重要組成部分，其中基底膜尤為重要。它由ECM分子如Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白構(gòu)成，為血管的完整性提供結(jié)構(gòu)支持[8]。MMPs是一組含鋅酶的基因家族，能降解基底膜成分，導(dǎo)致血腦屏障的破壞，參與到神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的反應(yīng)中。MMP－3的底物包括膠原(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型)、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等幾乎全部的ECM成分，是一種重要的調(diào)節(jié)ECM的蛋白酶。Falo等[9]報(bào)道MMP－3可以通過(guò)重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)突觸重建，調(diào)節(jié)腦損傷修復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在再灌注 6、12h、1、3、7d，治療組、對(duì)照組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療組、對(duì)照組MMP－3表達(dá)、EB滲出量明顯少于模型組;治療組MMP－3表達(dá)、EB滲出量明顯少于對(duì)照組。提示芪棱湯可能通過(guò)抑制MMP－3的活化介導(dǎo)的血腦屏障的破壞，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷，且芪棱湯優(yōu)于芪棱湯去養(yǎng)陰藥湯，即益氣養(yǎng)陰活血法優(yōu)于益氣活血法。

表2 各組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP－3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/視野，±s)

表2 各組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP－3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/視野，±s)

組別假手術(shù)組模型組對(duì)照組治療組6h 1.13 ±0.76 8.82 ± 1.42 5.21 ±1.03＊2.08 ±0.44＊△12h－12.15 ± 0.97 8.33 ±0.74＊5.21±1.01＊△1d－19.21 ± 1.38 14.35 ± 1.76＊11.03±0.68＊△3d－21.56 ± 0.81 17.03 ± 1.17＊13.41±1.07＊△7d－15.33 ± 1.07 10.16 ±1.33＊5.73 ±0.82＊△

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Effect of Qileng Decoction on the Blood-brain Barrier Permeability and the MMP-3 Expression in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion

ZHOU Rong-feng
Shiyan People’s Hospital， Baoan District， Shenzhen City， Guangdong Province(Shenzhen 518108)

Objective:To study the effect of Qileng Decoction on the blood-brain barrier permeability and the MMP-3 expression in rats with cerebral ischemia reperfusion.MethodsRats were randomly divided into the sham-operation group， the model group， the control group and the treatment group.The control group was given Qileng Decoction without nourishing yin herb.The treatment group was used Qileng Decoction.The MCAO model was established by the method of internal carotid artery occlusion by suture.The variation of the blood-brain barrier permeability was detected by the EB content exudation vascular.The MMP-3 expressions in different time points were detected by the immunohistochemistry method.ResultsIn different reperfusion time points， there were some significant differences in the treatment group， the control group and the model group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group and the control group were lower obviously than those of the model group.There was a remarkable difference between the treatment group and the control group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group were lower significantly than those of the control group.ConclusionThe mechanism of that Qileng Decoction could protect the function after cerebral ischemia reperfusion could be related to its inhibition the MMP-3 expression to protect the blood-brain barrier.

Cerebral ischemia reperfusion injury;Qileng Decoction;Blood-brain barrier;MMP-3

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1554－03

2010－03－08)