清腸化濕方對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸TLR-4、NF-κBp65蛋白表達的影響

顧培青 沈 洪 劉 麗 朱 磊 葉 柏 朱萱萱

1 南京中醫(yī)藥大學博士生（南京 210029）

2 江蘇省中醫(yī)院（南京 210029）

3 南京中醫(yī)藥大學碩士生（南京 210029）

清腸化濕方對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸TLR-4、NF-κBp65蛋白表達的影響

顧培青1沈 洪2△劉 麗2朱 磊3葉 柏2朱萱萱2

目的觀察三硝基苯磺酸（TNBS）法潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜TLR-4、NF-κBp65的變化特點及清腸化濕方對TLR-4、NF-κBp65蛋白表達的影響。方法 采用TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎模型。將大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、清腸化濕方組、巴柳氮組，治療10d后處死大鼠取新鮮結腸標本，觀察黏膜大體形態(tài)及組織學改變，并采用Western blot法檢測TLR-4、NF-κBp65蛋白表達水平。結果 模型對照組TLR-4、NF-κBp65蛋白表達均高于正常對照組，清腸化濕方組TLR-4、NF-κBp65的表達低于模型對照組，同時清腸化濕方組大鼠結腸形態(tài)及組織學損傷評分均有降低。結論清腸化濕方對潰瘍性結腸炎模型大鼠具有治療作用，抑制TLR-4、NF-κBp65的表達可能是其作用機制之一。

清腸化濕方 潰瘍性結腸炎 三硝基苯磺酸 大鼠 TLR-4 NF-κBp65 Western blot

1 南京中醫(yī)藥大學博士生（南京 210029）

2 江蘇省中醫(yī)院（南京 210029）

3 南京中醫(yī)藥大學碩士生（南京 210029）

△通訊作者

潰瘍性結腸炎 （UC）是一種反復發(fā)作的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，其病機復雜，病因尚未完全闡明，免疫學因素被認為是主要方面。隨著免疫學、分子生物學等學科的迅速發(fā)展，通過抑制Toll樣受體 （TLRs）/核因子-κB（NF-κB）通路的關鍵分子進而阻斷UC的炎癥反應已成為研究熱點之一。中醫(yī)學認為，UC活動期以濕熱蘊結為主要病機。我們以清熱化濕、斂瘡生肌為治療原則，對劉完素治痢名方芍藥湯進行化裁，擬制清腸化濕方，用于輕中度UC的治療，取得了良好的效果。本實驗旨在采用TNBS誘發(fā)大鼠UC模型，觀察清腸化濕方對結腸黏膜TLR-4、NF-κBp65蛋白表達的影響，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室實驗動物中心提供，SPF級環(huán)境飼養(yǎng);清腸化濕方（黃連、黃芩、白頭翁、煨木香、炒當歸、炒白芍、生地榆、白蘞、肉桂、生甘草）由江蘇省中醫(yī)院藥材科提供顆粒劑，按10倍成人用量即16g/kg用蒸餾水配成質量濃度為1.6g/mL懸液;巴柳氮鈉片（山西安特生物制藥股份有限公司生產(chǎn)），研磨后取10倍成人用量即1.05g/kg用蒸餾水配成質量濃度為0.1g/mL溶液;5%TNBS溶液[西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司];全細胞蛋白提取試劑盒 （Active motif公司）;BCA-100蛋白質定量測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）;預先染色的蛋白分子量標準品（Marker，F(xiàn)ermentas life Sciece公司），兔抗TLR4、NF-κBp65多克隆抗體，兔抗β-actin多克隆抗體 （Santa Cruz公司）;顯色法免疫檢測試劑盒（Invitrogen公司）;ZFMQ050PE型超純水器（Millipore公司）;3K-30Z型高速冷凍離心機（Sigma公司）;A5002型酶聯(lián)免疫檢測儀（Tecan公司）;垂直電泳儀（GE公司）;半干式轉膜儀、硝酸纖維素膜（Bio-Rad公司）;ECL發(fā)光劑 （GE公司）;柯達活體成像儀cymentre2000（Kodak公司）;GS-800型光密度掃描儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法 （1）造模：采用TNBS灌腸法制作UC大鼠模型[1]。造模型前禁食24h，留取部分動物作為正常對照組，其余大鼠10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉;用16號大鼠灌胃針輕輕從肛門插入，推入TNBS溶液（100mg/kg TNBS+50%乙醇0.25mL），捏緊肛門提尾倒立2min后放回籠中自然蘇醒，并常規(guī)飼養(yǎng)。（2）給藥方法與標本留?。涸炷：蟮?日，模型動物分為模型對照組、清腸化濕方組和巴柳氮組，并同時按上述劑量給藥，給藥體積為10mL/kg。正常對照組及模型組給等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)10d。末次給藥24h后，脫頸椎法處死大鼠，取肛門至盲腸部結腸（約8cm），沿腸系膜縱軸剪開，用冷生理鹽水沖洗干凈后4%多聚甲醛固定，進行肉眼大體形態(tài)評分，腸組織一部分石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色鏡下評價炎癥和潰瘍，另一部分-70℃凍存，用于結腸組織中TLR-4、NF-κBp65的檢測。（3）大體形態(tài)及組織學評分：大體形態(tài)按Ekstrom[2]所述的標準進行評分：無損傷計0分，黏膜充血計1分，潰瘍面積≤受損面積25%計2分，潰瘍面積為受損面積25%～50%計3分，潰瘍面積≥受損面積50%計4分，分值范圍為0～5分。組織學評分參照Dieleman等[3]標準，根據(jù)結腸潰瘍深度、范圍、炎癥程度進行評分。病變深度：無病變計0分，病變侵及黏膜層計1分，病變侵及黏膜下層計2分，病變侵及肌層計3分，病變侵及漿膜層計4分。病變范圍：無病變計0分，0% ～25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;炎癥程度：無炎癥計0分，輕度計1分，中度計2分，重度計3分;分值范圍為0～11分。（4）Western blot法檢測結腸組織中TLR-4、NF-κBp65的表達水平：取結腸黏膜按試劑盒說明書提取全細胞蛋白，用BAC-100蛋白質定量測定試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白提取液10μL，加等體積的2倍上樣緩沖液 （50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍，1mol/L DTT），沸水浴煮3min，點樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDSPAGE電泳，20mA穩(wěn)流電泳3h。剪取與凝膠大小一致的硝酸纖維素膜及6張Whatman 3mm濾紙，浸于轉移緩沖液（48mmol/L Tris-HCl pH8.3，39mmol/L 甘氨酸，0.037%SDS）中 5min，按下列順序放置于Bio-Rad電轉移裝置上：3層濾紙、硝纖膜、凝膠、3層濾紙（注意去除氣泡），20V穩(wěn)壓轉移1.5h。將硝纖膜取出置一平皿中，加封閉液 （含1%牛血清白蛋白的TBST，10mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05%Tween-20），室溫封閉4h，棄去封閉液，加入1∶1500稀釋的抗TLR4、NF-κBp65多抗（用TBST稀釋），4℃反應24h，TBST漂洗3次，每次15min。加入羊抗兔IgG-HRP（TBST稀釋 1∶5000 Santa Cruz公司），室溫作用2h，TBST充分漂洗3次，每次15min。加入ECL顯色液，置于柯達活體成像儀中觀察結果，條件設置為曝光5min，CCD自動獲取圖片結果。相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以 β -actin（1 ∶1000，Santa Cruz公司，43kD）內參照校正。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用方差分析。

2 結果

2.1 各組大體形態(tài)評分 見表1。模型組大鼠可見腸道粘連，腸管脹氣，腸壁增厚并變硬，局部充血、糜爛，可見明顯潰瘍。清腸化濕方組及巴柳氮組均較模型組有改善，巴柳氮組有2只大鼠可見淺潰瘍，其余恢復正?；蛴胁煌潭鹊某溲?、水腫及糜爛，清腸化濕方組及巴柳氮組大體形態(tài)評分與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。清腸化濕方組與巴柳氮組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠結腸大體形態(tài)、病理組織學評分比較 （分，±s）

表1 各組大鼠結腸大體形態(tài)、病理組織學評分比較 （分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05

n組 別清腸化濕方巴柳氮組模型對照組10 9 8大體形態(tài)評分0.80±0.63*1.11±0.60*2.50±0.92病理組織學評分2.60±0.84*3.40±1.01*6.75±1.98

2.2 各組組織學損傷評分 見表1。模型對照組大鼠結腸黏膜組織可見黏膜、黏膜下層可見廣泛潰瘍形成，大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，腺體破壞，結構紊亂，杯狀細胞減少，隱窩膿腫形成。清腸化濕方組及巴柳氮組較模型組明顯好轉，主要表現(xiàn)為中度慢性炎癥，部分黏膜及黏膜下層仍有少量炎細胞浸潤，壞死的黏膜上皮基本修復，潰瘍愈合，腺體杯狀細胞增多，隱窩膿腫消失，較模型對照組明顯減輕。清腸化濕方組結腸病理組織學評分和巴柳氮組較模型組結腸病理組織學評分差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），清腸化濕方組與巴柳氮組結腸病理組織學評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組結腸組織中TLR-4蛋白表達比較 見表2，圖1。模型對照組大鼠結腸組織中TLR-4表達明顯升高，與正常對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。清腸化濕方組及巴柳氮組TLR-4表達較模型對照組均降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），清腸化濕方組與巴柳氮組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠結腸組織中TLR-4蛋白表達比較 （±s）

表2 各組大鼠結腸組織中TLR-4蛋白表達比較 （±s）

與正常對照組比較，△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05。下同

n組 別清腸化濕方組巴柳氮組模型對照組正常對照組10 9 8 8灰度比值0.58±0.17*0.62±0.15*0.83±0.18△0.14±0.06

圖1 結腸組織中TLR-4蛋白表達

2.4 各組結腸組織中NF-κB p65表達比較 見表3，圖2。模型對照組大鼠結腸組織中NF-κB p65表達明顯升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。清腸化濕方組及巴柳氮組NF-κB p65較模型對照組均有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。清腸化濕方組與巴柳氮組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65蛋白表達比較 （±s）

表3 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65蛋白表達比較 （±s）

n 組 別清腸化濕方組巴柳氮組模型對照組正常對照組10 9 8 8灰度比值0.39±0.15*0.41±0.12*0.77±0.13△0.08±0.03

圖2 結腸組織中NF-κB p65蛋白表達

3 討論

潰瘍性結腸炎近年來在我國的病例報道有逐年增加趨勢[4]，已成為臨床常見的難治性疾病。UC的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但免疫因素在UC中的重要作用已被廣大學者所公認，即異常的免疫反應或正常免疫調節(jié)的破壞是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

Toll樣受體 （TLRs）是一類廣泛分布在免疫細胞尤其非特異性免疫細胞以及某些體細胞表面的模式識別受體（PRR）。TLRs通過識別某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結構，即病原體相關分子模式（PAMPs），從而介導固有免疫及特異性免疫應答的啟動。TLRs作為機體炎性反應鏈的啟動蛋白，為UC的病機研究提供了新的方向。迄今為止在哺乳動物細胞膜上已發(fā)現(xiàn)有10種TLRs，包括TLR-1～10，其中TLR-4被認為與宿主的免疫功能關系密切。TLR-4主要識別革蘭陰性菌的胞壁成分脂多糖（LPS）并被激活，向細胞內傳遞活化信號激活NF-κB，從而促進腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等多種炎癥因子的轉錄，導致結腸黏膜的炎癥和損傷。研究表明[5]，正常機體中TLR-4在腸上皮細胞僅微量表達，降低了對腸腔中細菌LPS的識別，從而維持腸道對自身菌群的免疫耐受;而在UC中TLR-4表達顯著上調，對LPS呈現(xiàn)異常識別，發(fā)生對自身菌群的耐受缺失。可見，TLR-4在結腸組織中高表達是UC發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。

核因子（NF）-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質。一般狀態(tài)下，NF-κB二聚體與一種被稱為IκB的抑制蛋白結合形成三聚體，以無活性形式存在于細胞漿中。當細胞受到刺激時，IκB激酶（IκK）被磷酸化，IκK即從無活性狀態(tài)轉為活性狀態(tài)，進而磷酸化IkB，磷酸化、泛酸化的IκB再被26S蛋白酶小體降解，受其抑制的NF-κB得以釋放，脫離NF-κB-IκB三聚體，由胞質進入核內，與相應靶基因中的啟動子或增強子κB位點結合，誘導靶基因的轉錄，從而直接參與機體對炎癥及免疫反應的調控。NF-κB在許多炎癥反應中發(fā)揮樞紐作用，尤其是NF-κBp65亞群的激活與UC密切相關。Rogler等[6]采用免疫熒光和免疫組化技術，用特異性的p65單克隆抗體，原位證實了UC患者腸黏膜巨噬細胞和上皮細胞NF-κBp65表達比正常對照者明顯增強，且其表達與炎癥的嚴重程度呈正相關。研究已經(jīng)證實，大部分細胞因子的啟動子中均含有NF-κB結合位點，因此，活化的NF-κB可以與這些細胞因子結合并促進其大量表達，引起炎癥反應，并使炎癥反應放大。NF-κB除調控炎性細胞因子的表達外，與細胞存活和凋亡也密切相關。

本實驗表明，UC模型大鼠模型對照組TLR-4、NF-κBp65蛋白表達明顯高于正常對照組，清腸化濕方組TLR-4、NF-κBp65蛋白表達均低于模型對照組。提示TNBS法大鼠UC的發(fā)病與TLR-4、NF-κBp65的高表達有關，中藥清腸化濕方對TNBS法UC大鼠結腸TLR-4、NF-κBp65的表達具有抑制作用，這可能是清腸化濕方治療UC的作用機制之一。

[1]張濤,謝建群.大鼠潰瘍性結腸炎模型的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志,2006,14（4）:240～242.

[2]Ekstrom GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide,cyclosporin A,and 5-aminosalicylic acid[J].Scand J Gastroenterol,1998，33（2）:174 ～179.

[3]Dieleman LA,Palmen MJ,Akol H,et al.Chronicexperimental colitis induced by dextran sulphate sodium（DSS）is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol,1998，114（3）:385 ～391.

[4]歐陽欽,胡品津,錢家鳴,等.對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見[J]. 胃腸病學，2007，12（8）：488 ～495.

[5]Abreu MT,Vora P,Faure E,et al.Decreased expression of Toll-like receptor-4 and MD-2 correlates with intestinal epithelial cell protection against dysregulated proinflammatory gene expression in response to bacterial lipopolysaccharide[J].J Immunol，2001，167:1609～1616.

[6]Rogler G,Brand K,Vogl D,et al.Nuclear factor-κB is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinal mucosa[J].Gastroenterology,1999，115:357 ～369.

Effects of Qingchanghuashifang Decoction on Protein Levels of TLR-4 and NF-κBp65 in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis

GU Pei-qing1,SHEN Hong2,LIU Li2,et al
1 Nanjing University of Chinese Medicine（Nanjing 210029）
2 Jiangsu Province Hospital of TCM（Nanjing 210029）

Objective:To observe the effect of Qingchanghuashifang Decoction（QD）on the protein expressions and change character of TLR-4 and NF-κBp65 in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis（UC）.Methods:Rat UC model induced by trinitrobenzene-sulfonic acid （TNBS）were randomly divided into normal group,model group,QD group,and balsalazide sodium tablet（BST）group.The rats were sacrificed to get their colonic mucosa and extract the whole-cell protein after 10d of treatment.Western blot was performed to detect the protein levels of TLR-4 and NF-κBp65.Results:The relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65 in the model group were all higher than those in the normal group significantly.The relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65 in the QD group were lower than that in the model group.The colonic configurative and histologic injury score were declined.Conclusion:Qingchanghuashifang Decoction can cure ulcerative colitis.One of the mechanisms may be that Qingchanghuashifang Decoction can inhibit the relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65.

Qingchanghuashifang Decoction;Ulcerative colitis;Trinitrobenzen-sulphonic acid;Rats;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-kappaBp65;Western blot

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0099-03

2009-07-21）