胃腸舒片對(duì)胃腸功能障礙大鼠胃腸道乙酰膽堿及P物質(zhì)的影響*

李 瓊 劉同慎 劉孟安△

1 濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（煙臺(tái) 264003）

2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院（煙臺(tái) 264003）

胃腸舒片對(duì)胃腸功能障礙大鼠胃腸道乙酰膽堿及P物質(zhì)的影響*

李 瓊1劉同慎2劉孟安1△

目的探討中藥胃腸舒片促進(jìn)胃腸動(dòng)力作用機(jī)理。方法將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、胃腸舒小劑量組、胃腸舒大劑量組、西沙必利組。除正常對(duì)照組外，其余4組均制備胃腸動(dòng)力障礙動(dòng)物模型，分別用等容積的受試藥液灌胃，連續(xù)7d，將各組動(dòng)物麻醉后選取胃腸標(biāo)本。免疫組化法觀察神經(jīng)遞質(zhì)Ach及P物質(zhì)的表達(dá)變化，采用圖像分析儀測(cè)定其肌間神經(jīng)叢光密度值。結(jié)果中藥胃腸舒片能明顯增加胃腸組織中Ach及P物質(zhì)分泌，與模型組比較有顯著差異。結(jié)論中藥胃腸舒促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制，可能是通過(guò)增加胃腸道Ach及P物質(zhì)分泌，Ach及P物質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合，增加胞內(nèi)Ca2+濃度，Ca2+信號(hào)系統(tǒng)引發(fā)一系列生理功能，從而促進(jìn)胃腸平滑肌的收縮效應(yīng)。

中藥 胃腸舒片 神經(jīng)遞質(zhì) 乙酰膽堿 P物質(zhì)

1 濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（煙臺(tái) 264003）

2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院（煙臺(tái) 264003）

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30873263）

△通訊作者

中藥胃腸舒片是我們研制的促胃腸動(dòng)力藥（批準(zhǔn)文號(hào)：魯藥制字Z1620030009），對(duì)胃腸動(dòng)力障礙性疾病療效滿意[1～3]。現(xiàn)就其作用機(jī)制探討如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重180～200g，購(gòu)自煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;西沙必利由山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司生產(chǎn);胃腸舒片由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供;兔抗大鼠多克隆乙酰膽堿酯酶抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;P物質(zhì)兔抗大鼠多克隆抗體由北京博奧森生物工程有限公司提供;SP法免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;病理圖像分析系統(tǒng)為美國(guó)Media Cybernetics產(chǎn)品。

1.2 方法 （1）造模及標(biāo)本處理：將50只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、胃腸舒小劑量組、胃腸舒大劑量組、西沙必利組。除正常對(duì)照組外，其余4組參考食積動(dòng)物模型方法[4]制備腸動(dòng)力障礙實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。造模成功后各組給予相應(yīng)藥物：正常對(duì)照組不給任何藥物，模型組給予生理鹽水，胃腸舒小劑量組給胃腸舒溶液（含生藥75mg/mL），胃腸舒大劑量組給胃腸舒溶液（含生藥150mg/mL），西沙必利組給西沙必利混懸液 （含生藥0.51mg/mL），均20mL/kg，每日2次灌胃。實(shí)驗(yàn)給藥第7日各組動(dòng)物禁食24h（不禁水、藥），于次日以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取胃竇、空腸（十二指腸與空腸交接下0.5cm處）標(biāo)本，4%冷多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5μm。（2）免疫組化法觀察神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿及P物質(zhì)的表達(dá)變化：應(yīng)用免疫組化SP法，取相鄰兩套切片在60℃溫箱烘24h以上，常規(guī)脫蠟至水，用0.3%過(guò)氧化氫甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30min（室溫），微波修復(fù)抗原（抗原修復(fù)液為pH 6.0檸檬酸緩沖液）10min后室溫冷卻，經(jīng)PBS液漂洗后，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37℃孵育30min，兩套切片分別滴加兔抗大鼠乙酰膽堿酯酶多克隆抗體（效價(jià)1∶50）、兔抗大鼠P物質(zhì)多克隆抗體（效價(jià)1∶75），4℃過(guò)夜，PBS漂洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min，PBS漂洗后，滴加辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS液漂洗后，DAB顯色，將切片置流水中終止呈色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，以梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片待檢。（3）圖像分析處理：用顯微圖像分析系統(tǒng)，將待測(cè)切片放置在連接計(jì)算機(jī)的顯微鏡下，分別對(duì)免疫組化染色切片中的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行定量分析。觀察肌間神經(jīng)叢中陽(yáng)性神經(jīng)元的染色及分布情況，每張切片上，每只大鼠胃及小腸組織于40倍物鏡下選取5個(gè)視野采集圖像。將圖像掃描至計(jì)算機(jī)，計(jì)算出每個(gè)視野陽(yáng)性染色的光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示,采用方差分析及組間兩兩比較。

2 結(jié)果

圖1 胃腸道乙酰膽堿神經(jīng)元表達(dá)

各組胃腸道乙酰膽堿酯酶與P物質(zhì)的表達(dá)變化、胃竇與小腸肌間神經(jīng)叢的光密度值結(jié)果見(jiàn)表1、圖1、圖2。從表1可見(jiàn)，模型對(duì)照組胃竇與空腸組織中AchE及P物質(zhì)均低于正常對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明復(fù)制的胃腸動(dòng)力障礙性動(dòng)物模型成功，并提示胃腸道興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Ach及P物質(zhì)分泌減少是胃腸動(dòng)力障礙的主要原因。胃腸舒小、大劑量組及西沙必利組用藥后，胃竇和空腸組織中AchE及P物質(zhì)均高于模型對(duì)照組 （P＜0.01），胃腸舒大劑量組胃竇組織AchE、胃竇和空腸組織中P物質(zhì)增加的幅度大于西沙必利組（P＜0.01）。提示中藥胃腸舒促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制與增加胃腸道興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Ach及P物質(zhì)分泌有關(guān)。

表1 各組胃竇和小腸腸肌間神經(jīng)叢光密度值比較（±s）

表1 各組胃竇和小腸腸肌間神經(jīng)叢光密度值比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.01;與西沙比利組比較,▲P＜0.01

正常對(duì)照組模型對(duì)照組胃腸舒小劑量組胃腸舒大劑量組西沙必利組10 10 10 10 10胃竇0.1611±0.0039 0.1493±0.0076*0.1979±0.0083△0.1981±0.0049△▲0.1750±0.0129△空腸0.1524±0.0089 0.1371±0.0075*0.1899±0.0107△0.1931±0.0135△0.1885±0.0142△胃竇0.1064±0.0057 0.0961±0.0128*0.1099±0.0079△0.1333±0.0056△▲0.1176±0.0072△空腸0.1274±0.0071 0.1117±0.0103*0.1168±0.0077 0.1263±0.0092△▲0.1155±0.0072組 別 n AchE P物質(zhì)

圖2 胃腸道P物質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)

3 討論

胃腸動(dòng)力障礙性疾病屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”范疇，以腹部痞滿不舒，或脹痛、納呆、早飽、食后飽脹、惡心、嘔吐、噯氣等為主要臨床表現(xiàn)。多由胃腸淤滯，氣機(jī)不暢，以致脾胃升降失司所致。治療重在瀉胃腸積滯，通胃腸腑氣，恢復(fù)脾胃升降協(xié)調(diào)。中藥胃腸舒片中大黃瀉胃腸積滯,通胃腸腑氣為君藥;枳實(shí)行氣消脹，破積除滿為臣藥;甘草健脾益氣，甘緩和中，調(diào)和諸藥，防大黃攻下傷正之弊為佐使。故諸藥相互配伍，以瀉胃腸積滯，調(diào)暢胃腸氣機(jī)，恢復(fù)脾胃升降協(xié)調(diào)而達(dá)到治療目的。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病主要病理生理基礎(chǔ)為胃排空延遲及小腸傳輸功能障礙[5，6]。中藥胃腸舒能加快胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)，其作用機(jī)理與其加大胃腸平滑肌自發(fā)活動(dòng)的收縮幅度有關(guān)，而對(duì)收縮頻率無(wú)明顯影響[7]。故中藥胃腸舒片治療胃腸動(dòng)力障礙性疾病，其組方既符合中醫(yī)辨證論治，也符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)。

胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)生可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腸肌間神經(jīng)叢、胃腸道平滑肌等有關(guān)，這些組織結(jié)構(gòu)的功能聯(lián)系依賴于各種神經(jīng)遞質(zhì)和體液因子的釋放，各種遞質(zhì)與相應(yīng)的受體結(jié)合，執(zhí)行不同的生理功能，成為胃腸動(dòng)力藥發(fā)揮藥理作用的生理學(xué)基礎(chǔ)[8，9]。Ach作為膽堿能神經(jīng)釋放的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)胃腸平滑肌的收縮起著重要作用[10]，用于研究生理或病理狀態(tài)下胃腸運(yùn)動(dòng)變化[11，12]。目前公認(rèn)AchE活性增強(qiáng)則代表Ach釋放增加，膽堿能神經(jīng)興奮性增高。副交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放Ach作用于平滑肌M受體后可開(kāi)放質(zhì)膜上L型Ca2+通道，使Ca2+內(nèi)流使胃腸平滑肌收縮[13～16]。P物質(zhì)作為一種重要的胃腸肽，對(duì)胃腸道的興奮作用表現(xiàn)為對(duì)胃腸縱行肌和環(huán)行肌的雙重收縮效應(yīng)，包括直接的短時(shí)作用和緊隨的由膽堿能神經(jīng)釋放Ach引起的長(zhǎng)時(shí)作用[17]。P物質(zhì)與其相應(yīng)受體結(jié)合,激活磷酸脂酶C,使磷脂酰肌醇二磷酸水解,產(chǎn)生肌醇三磷酸而使胞內(nèi)鈣濃度升高，Ca2+信號(hào)系統(tǒng)引發(fā)一系列生理功能，包括胃腸平滑肌的收縮效應(yīng)[18]。實(shí)驗(yàn)顯示SP可激活兩種不同的鈣內(nèi)流通道[19]。本研究表明，模型對(duì)照組胃竇及空腸AchE及P物質(zhì)較正常對(duì)照組顯著減少，提示復(fù)制胃腸動(dòng)力障礙的動(dòng)物模型成功。經(jīng)用中藥胃腸舒片后，胃竇和空腸部AchE及P物質(zhì)的分泌均較模型對(duì)照組顯著增加。結(jié)合既往研究證實(shí)中藥胃腸舒片能顯著增加胃腸平滑肌細(xì)胞游離Ca2+濃度[20]，筆者認(rèn)為中藥胃腸舒片促胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制，可能是通過(guò)增加胃腸道Ach及P物質(zhì)的分泌，Ach及P物質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合，增加胞內(nèi)Ca2+濃度，Ca2+信號(hào)系統(tǒng)引發(fā)一系列生理功能，而促進(jìn)胃腸平滑肌收縮效應(yīng)。

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Influence of Weichangshu Tablet on Ach and Substance P in Gastrointestinal Tract of Rats with Gastrointestinal Dysfunction

LI Qiong1,LIU Tong-shen2,LIU Meng-an1△
1 Integrated Traditional and Western Medicine College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）
2 Basic College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）

Objective:To investigate the effect of Weichangshu Tablet on gastrointestinal motility.Methods:50 Wistar rats were divided into 5 groups randomly:normal group,model group,low dosage Weichangshu Tablet group,high dosage Weichangshu Tablet group and cisapride group.In addition to the normal group,the other 4 groups were prepared animal models of gastrointestinal motility disorder.The groups were given the same volume solution of corresponding medicine by gastric perfusion for 7d.The gastrointestinal samples were taken after rats were anesthetized.The expression change of Ach and substance P were determined by immunohistochemical method.The optical density of myenteric plexus were measured with mitrosperegraph.Results:Weichangshu Tablet could effectively increase Ach and substance P in gastrointestinal tract.Compared with model group,there was significant difference.Conclusion:The mechanism of Weichangshu Tablet promoting gastrointestinal motility may be that can increase Ach and substance P,which act on corresponding receptors and enhance the Ca2+concentration then the Ca2+signal system cause gastrointestinal smooth muscle contraction.

Traditional Chinese medicine;Weichangshu Tablet;Neurotransmitter;Acetylcholine;Substance P

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0096-03

2009-07-28）