清熱化瘀滋陰方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞凋亡及臨床指標的影響*

梁 衛(wèi) 張麗玲 龔 林 金 琳 蔡 鷹 黃重發(fā) 唐永明

解放軍第454醫(yī)院（南京 210002）

清熱化瘀滋陰方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞凋亡及臨床指標的影響*

梁 衛(wèi) 張麗玲 龔 林 金 琳 蔡 鷹 黃重發(fā) 唐永明

目的觀察中藥清熱化瘀滋陰方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血淋巴細胞凋亡及臨床指標的影響。方法 選取SLE患者80例，隨機分為治療組（清熱化瘀滋陰方聯(lián)合激素）與對照組（單用激素）各40例，服藥3個月比較兩組患者外周血淋巴細胞凋亡情況及臨床指標變化。結(jié)果兩組治療后外周血淋巴細胞凋亡率均較治療前明顯下降，治療組明顯低于對照組;治療組血常規(guī)、血沉、免疫球蛋白（IgG）、補體C3、抗核抗體（ANA）、抗ds-DNA抗體均較治療前明顯改善，且白細胞、血小板、C3、IgG、ANA指標的恢復(fù)優(yōu)于對照組。結(jié)論清熱化瘀滋陰方治療活動期SLE有明顯優(yōu)勢，臨床指標明顯改善，其可能通過降低外周血淋巴細胞凋亡率，改善免疫紊亂而發(fā)揮作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 清熱化瘀滋陰方

解放軍第454醫(yī)院（南京 210002）

*南京軍區(qū)“十一五”攻關(guān)課題面上項目（No.06MA73）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種多因素參與的多臟器多系統(tǒng)損害并伴有多種免疫學異常的自身免疫性疾病。目前多采用激素、免疫抑制劑治療該病,但不良反應(yīng)較多。我們近年針對SLE活動期以血熱瘀毒、腎虛陰虧證為多見，采用清熱化瘀滋陰方配合激素治療SLE患者40例，臨床各項指標好轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)SLE發(fā)病與淋巴細胞凋亡密切相關(guān)[1]，筆者運用流式細胞儀檢測SLE患者服藥前后外周血淋巴細胞凋亡率的變化，探討清熱化瘀滋陰方治療SLE的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年12月～2008年12月解放軍第454醫(yī)院、江蘇省中醫(yī)院門診及住院SLE患者80例，隨機分為治療組與對照組各40例。治療組男性6例,女性34例;年齡18～60歲,平均30.5歲;病程2個月至5年,平均2.0年。對照組40例,男性5例,女性35例;年齡18～58歲,平均29.9歲;病程3個月至6年，平均2.3年。兩組資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 病例選擇 西醫(yī)診斷按照1992年美國風濕病協(xié)會制定的SLE診斷標準[2];中醫(yī)辨證參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[3]屬“熱毒、血瘀、陰虛”證。排除妊娠期、哺乳期婦女，合并有心、肝、腎、肺、腦、造血系統(tǒng)有嚴重損傷或嚴重感染者，以及其他自身免疫性疾病者。

1.3 治療方法 對照組予強的松30mg/d，頓服。治療組在此基礎(chǔ)上另予清熱化瘀滋陰方：水牛角片12g（先煎），生地黃 12g，麥冬 12g，丹皮 10g，赤芍 10g，金銀花18g，連翹12g，白花蛇舌草20g，青風藤15g，秦艽10g，紫草10g，炒白術(shù)10g。每日1劑，加水300mL浸泡30min，水牛角片先煎30min，再加入其它藥同煎，武火煮沸后改文火煎20min，濃縮約100mL，每日2次溫服。兩組均以3個月為1個療程，治療1個療程。

1.4 檢測指標 （1）SLE患者外周血淋巴細胞凋亡的檢測。試劑與儀器：淋巴細胞分離液、Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒均購于深圳晶美生物工程有限公司;流式細胞儀為美國B＆G公司生產(chǎn)。SLE患者外周血淋巴細胞的分離：分別抽取患者服藥前及服藥3個月后清晨空腹肘靜脈血2mL,置100g/L EDTA抗凝的無RNA酶試管中,用0.9%氯化鈉溶液對倍稀釋，緩慢加入2mL淋巴細胞分離液之上,2000r/min離心20min,取淋巴細胞層,加0.9%氯化鈉溶液稀釋洗滌,1500r/min離心15min,棄上清，再加0.9%氯化鈉溶液1mL稀釋混勻,移入1.5mL Eppendorf管，1500r/min離心10min，棄上清。流式細胞儀檢測SLE患者外周血淋巴細胞凋亡率：制備外周血淋巴細胞，去離子水按1∶4稀釋結(jié)合緩沖液，用預(yù)冷PBS洗細胞2次，用250μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，濃度為1×106/mL，取100μL細胞懸液于5mL流式管中，加5μL Annexin VFITC和10μL 20μg/mL碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15min，加400μL PBS，流式細胞儀分析結(jié)果。（2）臨床檢測指標：血常規(guī)采用五分類血細胞分析儀 （美國Beckman-coulter公司生產(chǎn)）;血沉采用E＆H-64型儀器及ESR試劑盒檢測 （Steellex Instrument公司生產(chǎn)）;IgG、補體C3、ANA、抗ds-DNA抗體采用美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的儀器及IgG、補體C3、ANA、抗ds-DNA抗體試劑盒檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示,采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后外周血淋巴細胞凋亡率比較 見表1。結(jié)果表明，活動期SLE患者外周血淋巴細胞凋亡率明顯升高，治療組治療后淋巴細胞凋亡率較治療前明顯下降（P＜0.01），與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。

2.2 兩組治療前后臨床指標比較 見表2，表3。結(jié)果表明，治療組治療后較治療前ESR、IgG、ANA、抗ds-DNA抗體明顯下降（P＜0.05或 0.01），補體C3及WBC、RBC、PLT明顯升高，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。對照組治療后ANA明顯下降（P ＜ 0.01），補體 C3、WBC、RBC、PLT 顯著升高（P ＜0.05或0.01）。兩組治療后比較，治療組改善明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05或0.01）。

表1 兩組治療前后外周血淋巴細胞凋亡率比較（%，±s）

表1 兩組治療前后外周血淋巴細胞凋亡率比較（%，±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與對照組治療后比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同

n組別治療組對照組40 40治療前11.97±3.08 13.11±2.58治療后2.26±0.62**△△6.35±1.46**

表2 兩組治療后血常規(guī)變化情況比較 （±s）

表2 兩組治療后血常規(guī)變化情況比較 （±s）

組別治療組（n=40）對照組（n=40）治療前治療后治療前治療后WBC（×109/L）3.05±0.33 4.52±0.98**△△3.10±0.37 3.41±0.85*RBC（×1012/L）3.47±0.28 4.12±0.38**3.48±0.93 3.91±0.67*PLT（×109/L）85.26±27.31 145.16±30.12**△△86.18±28.05 119.51±32.76**

表3 兩組治療后免疫學指標變化情況比較 （±s）

表3 兩組治療后免疫學指標變化情況比較 （±s）

組別抗ds-DNA抗體治療組（n=40）對照組（n=40）治療前治療后治療前治療后ESR（mm/h）57.80±28.31 45.35±21.63*60.78±35.65 53.17±9.61補體C3（g/L）0.50±0.18 0.95±0.26**△△0.46±0.09 0.79±0.15**IgG（g/L）22.58±4.22 18.37±3.69**△20.86±3.36 19.24±5.28 ANA（%）1∶（163.24±13.67）1∶（73.72±13.16）**△△1∶（145.31±13.50）1∶（83.18±13.55）**80.15±25.32 63.08±19.56**75.82±23.52 70.95±20.15

3 討論

SLE是一種全身性多器官自身免疫病,可侵犯身體多個器官，目前尚無特效療法。中醫(yī)學將其歸屬于“陰陽毒”、“日曬瘡”、“痹證”等范疇，多認為由于先天稟賦不足、肝腎陰虧,加之七情內(nèi)傷、勞倦過度、飲食內(nèi)傷、六淫侵襲、日光曝曬,致使邪毒乘虛而入,熱毒灼熾,耗傷津液,血脈瘀阻，初起侵襲肌表血脈筋骨，進而內(nèi)侵臟腑。本病初期的主要病機為熱熾、血瘀、陰虧。根據(jù)這一特點，我們擬用清熱化瘀滋陰方清熱涼血、解毒散瘀以治其標，養(yǎng)陰扶正以顧護陰液而治其本。方中以水牛角、白花蛇舌草瀉火解毒、涼血止血為主，配金銀花、連翹清熱解毒并透邪熱，取“入營猶可透熱轉(zhuǎn)氣”之意;生地黃以清熱涼血、養(yǎng)陰生津，與麥冬共同顧護陰液;赤芍、丹皮涼血散瘀;紫草涼血活血、解毒化斑;青風藤活血通絡(luò)止痛;生白術(shù)健脾化濕，顧護中焦脾胃。諸藥合用,補虛瀉實，正邪兼顧，瀉不傷正,涼血止血又活血散瘀。藥理研究證實水牛角片能縮短DIC大鼠凝血酶原時間、凝血酶時間，升高血小板數(shù)[4];白花蛇舌草可抗炎、調(diào)節(jié)免疫活性，其富含的熊果酸和齊墩果酸有增強免疫作用[5];赤芍總苷能降低血瘀大鼠血液黏度、纖維蛋白原含量和紅細胞聚集指數(shù)，減少紅細胞壓積，改善血液流變學指標[6]。臨床觀察表明，清熱化瘀滋陰方有明顯升高WBC、RBC、PLT、補體C3及降低ESR、IgG、ANA、抗ds-DNA抗體的作用。

近年研究認為SLE患者外周血淋巴細胞凋亡加速，并與SLE的疾病活動程度呈正相關(guān)[1]。正常生理情況下，細胞凋亡時凋亡小體可迅速被吞噬細胞或鄰近細胞吞噬。當細胞凋亡率加快，凋亡小體不能被及時清除，其內(nèi)含的核小體釋放入血，刺激機體產(chǎn)生抗DNA等多種自身抗體[7]。核小體作為自身抗原也可刺激機體產(chǎn)生核小體抗體，兩者結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球基底膜、血管內(nèi)膜等各組織器官，造成嚴重的免疫病理損傷[8]。另一方面，正常情況下發(fā)揮調(diào)理素功能的補體與巨噬細胞表面相應(yīng)補體受體結(jié)合，促使巨噬細胞吞噬、清除凋亡細胞。但SLE患者淋巴細胞的凋亡率升高，血清補體C3水平明顯下降，發(fā)揮調(diào)理素功能的補體減少，同時巨噬細胞表面相應(yīng)補體受體缺陷[9]，導致巨噬細胞吞噬凋亡細胞的功能下降。因此SLE發(fā)病與淋巴細胞凋亡增多及凋亡細胞清除障礙密切相關(guān)。本研究觀察了清熱化瘀滋陰方對SLE患者外周血淋巴細胞凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方配合激素能明顯降低SLE患者外周血淋巴細胞凋亡率，并顯著優(yōu)于單用激素，說明清熱化瘀滋陰方可能通過降低患者外周血淋巴細胞凋亡率，清除增多的凋亡細胞、凋亡小體及循環(huán)免疫復(fù)合物，調(diào)節(jié)免疫紊亂而發(fā)揮治療作用。至于該方對淋巴細胞凋亡相關(guān)基因Fas/FasL、Bcl-2等基因表達的影響，有待進一步研究。

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Effect of Qingrehuayuziyin Decoction on Lymphocyte Apoptosis and Other Clinical Indices of the Patients with Systemic Lupus Erythematosus

LIANG Wei,ZHANG Li-ling,Gong lin,et al
454 Military Hospital of China（Nanjing 210002）

Objective:To investigate the effect of Qingrehuayuziyin Decoction on lymphocyte apoptosis and other clinical indices of the patients with systemic lupus erythematosus（SLE）.Methods:80 SLE patients were selected and divided randomly into two groups.40 patients in the treatment group were given the Qingrehuayuziyin Decoction combined with the hormone.40 patients in the control group were just given the hormone.After 3 months,the lymphocyte apoptosis and the clinical indices were compared between two groups.Results:The rates of lymphocyte apoptosis decreased significantly in two groups.Meanwhile,the rate in the treatment group was lower obviously than that of the control group.Compared with the control group,there were some indices improving significantly in the treatment group including:the blood routine examination,the blood sedimentation,the IgG,the complement C3,the anti-nuclear antibody （ANA）and the double stain DNA antibody.In the treatment group,the recoveries of the leukocyte,platelet,C3,IgG and ANA were also superior to those of the control group.Conclusion:Qingrehuayuziyin Decoction has obvious advantage in SLE of active stage.From this method,the clinical indices improve obviously.This is related to the suppressing lymphocyte apoptosis and the modifying the immune status.

Systemic lupus erythematosus;Qingrehuayuziyin Decoction

R593.24

B

1004-745X（2010）01-0041-03

2009-07-02）