阿托伐他汀對(duì)腦缺血大鼠認(rèn)知功能的影響

劉福中, 龍建庭, 朱云龍, 游 詠

隨著人口老年化,血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)的發(fā)病率日益增高。據(jù) WHO統(tǒng)計(jì),在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家,血管性癡呆占全部癡呆的 10%～20%,而我國(guó)的一些研究資料顯示,血管性癡呆約占全部癡呆的 60%左右,這可能與資料的人口構(gòu)成、診斷方法和剔除標(biāo)準(zhǔn)的不同有關(guān),但在一定程度上提示血管性癡呆是我國(guó)老年性癡呆的主要組成部分,也是目前老年期癡呆中可預(yù)防和有希望治療的癡呆之一。他汀類藥物是作為降脂藥物被研發(fā)的,但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)它們還有許多降脂以外的作用,如拮抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防心腦血管事件、癡呆和骨質(zhì)疏松等[1]。大規(guī)模的臨床研究表明,使用他汀對(duì)預(yù)防血管性癡呆和改善認(rèn)知功能有益[2,3],其具體機(jī)制不祥。本研究通過(guò)觀察阿托伐他汀對(duì) SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其對(duì)海馬超微結(jié)構(gòu)的影響,以探討阿托伐他汀對(duì)血管性性癡呆大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性 SD大鼠30只,鼠齡 3～ 4月,體重(252.6±24.5)g,均由南華大學(xué)動(dòng)物部提供,許可證號(hào)為 SCXK(湘)2005-0010。全部大鼠在正常溫控、自然光照及自由攝食條件下飼養(yǎng)。30只大鼠隨機(jī)分為 3組:假手術(shù)組(10只 ),模型組 (10只),治療組(10只 )。

1.2 模型制作及給藥方法 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法[4]:用 6%的水合氯醛(5ml/kg)麻醉大鼠;成功后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒,頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,4號(hào)絲線雙重結(jié)扎;術(shù)中大鼠體溫保持在 36.5℃;縫合切口,放回籠中飼養(yǎng)。術(shù)后加強(qiáng)護(hù)理,可以有效避免大鼠死亡。假手術(shù)組大鼠只分離不結(jié)扎頸總動(dòng)脈,其余操作過(guò)程同模型組。模型建立后1w開(kāi)始,治療組給予阿托伐他汀 5mg·kg-1·d-1(1ml)藥物。由輝瑞公司生產(chǎn),規(guī)格為:20mg/片(立普妥,lipitor,生產(chǎn)批號(hào):75837005)灌胃,假手術(shù)組及模型組予以 1ml生理鹽水灌胃 4w。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)方法 灌胃 4w后,采用水迷宮試驗(yàn)分別檢測(cè) 3組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。Morris水迷宮包括一個(gè)盛水的圓形不銹鋼水池、隱藏在水面下的平臺(tái)以及帶有一套圖像自動(dòng)采集和處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。水池直徑 150cm,池深 60cm。水池按方位平均分為 4個(gè)假想的象限。將其中一個(gè)象限設(shè)置為目標(biāo)象限(target quadrant),即第 4象限。第四象限中間放置一個(gè)大小為 10×10cm2、高 29cm平臺(tái),平臺(tái)沒(méi)于水面下 1.5cm。水面布滿黑色浮動(dòng)的樹(shù)脂珠以隱蔽平臺(tái)。池四周的黃色幕壁上有視覺(jué)標(biāo)志(矩形、三角形、圓形及菱形)等距離分布作為遠(yuǎn)端線索,供游泳時(shí)的SD大鼠用來(lái)定位平臺(tái)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間平臺(tái)、水池及周圍環(huán)境保持不變。訓(xùn)練時(shí)水溫保持在(25℃±1℃)左右,室內(nèi)溫度保持在 20℃～25℃。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)(Cap7130Capture視頻組合),攝像頭對(duì)準(zhǔn)桶中心,與之相連的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡,采集并分析 Morris水迷宮數(shù)據(jù)和圖像結(jié)果。灌胃 4w后,通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力,24h后用空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的記憶能力,每天上午、下午各訓(xùn)練 1次,每次記錄 120s,連續(xù) 5d,計(jì)算各組 2次訓(xùn)練時(shí)間的平均值。大鼠在水迷宮中找到平臺(tái)的時(shí)間越短,游過(guò)的距離越短,表明動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。

1.4 標(biāo)本選擇與保存 行為學(xué)檢測(cè)后,每組隨機(jī)選取 5只大鼠電鏡檢查,剩余的 5只進(jìn)行 HE染色。大鼠麻醉成功后,以生理鹽水及 4%多聚甲醛快速灌注,在冰臺(tái)上,迅速離斷腦組織,按照海馬分區(qū)圖譜,取小鼠左側(cè)海馬 CA1區(qū)(平外側(cè)膝狀體水平)1×2×2mm3左右大小海馬(及左額葉組織塊)組織塊 2～3塊,放入 2.5%戊二醛磷酸緩沖液中沖洗后,保存在戊二醛溶液中,HE染色大鼠腦組織放在 4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 電鏡標(biāo)本的體視學(xué)分析 采用日立 H-7500透射電子顯微鏡,在 40,000倍數(shù)下,選擇神經(jīng)氈部位,雙盲情況下每組隨機(jī)拍照 40張。按 Gundersen法則[5]計(jì)數(shù)每張相片中 Gray1型突觸的數(shù)目;采用德國(guó) Soft Imaging System GmbH圖像分析軟件測(cè)量 Gray1型突觸截面積及周長(zhǎng),采用魔棒自動(dòng)測(cè)量突觸小泡的總面積。體視學(xué)方法為:δ=4/π×Bx/Ax;Na=Nx/Ar;Vv=Ax/Ar(δ為比表面;Bx為粒子周長(zhǎng);Ax為粒子截面積;π取 3.14;Ar為參照系截面積,Nx為參照系中顆粒截面數(shù)目)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,采用單因素方差分析進(jìn)行比較,兩兩之間比較采用 LSD法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 治療組與模型組相比較,逃避潛伏期縮短,游泳時(shí)間百分比增高,穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)增多,表明學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)均顯著升高(P＜0.05)。模型組與假手術(shù)組相比較,學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)均顯著降低(P＜0.05),表明模型建立成功(見(jiàn)表1)。

2.2 大鼠海馬區(qū) HE染色結(jié)果 假手術(shù)組海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞膜及核仁明顯,細(xì)胞排列整齊緊密,染色均一(見(jiàn)圖 1A)。模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞核深染、固縮,大量膠質(zhì)細(xì)胞增生,細(xì)胞退行性變明顯,可見(jiàn)空泡樣改變,組織間水腫較明顯(見(jiàn)圖 1B)。治療組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列較模型組整齊,細(xì)胞呈圓形或橢圓形,核仁清晰,細(xì)胞脫失較少見(jiàn),反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞減少,水腫較輕(見(jiàn)圖 1C)。

2.3 大鼠海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)元雙層核膜結(jié)構(gòu)清晰,核膜平行,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清楚,未見(jiàn)明顯腫脹及組織空泡樣變性,高爾基體結(jié)構(gòu)清楚,分布規(guī)律(圖 2A);模型組大鼠海馬組織中存在較大面積水腫,可見(jiàn)部分空泡樣變性;突觸數(shù)量較少,部分突觸中可見(jiàn)水腫,突觸中的突觸小泡數(shù)量明顯較少甚至基本消失,突觸間隙不清,突觸后膜厚度薄,突觸界面曲度不大(圖2B);治療組大鼠海馬組織中水腫、空泡樣變性面積較模型組明顯減少,基本消失。突觸結(jié)構(gòu)清楚,形態(tài)完整,數(shù)量明顯增多,突觸界面較長(zhǎng),曲率較大,突觸間隙較狹,突觸后膜厚度較厚(圖 2C)。

2.3.1 突觸的面數(shù)密度 設(shè)定 100μm2為參照系截面積。各組突觸的面數(shù)密度結(jié)果:治療組突觸面數(shù)密度較模型組明顯增多,比假手術(shù)組明顯減少,各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見(jiàn)表2)。

2.3.2 截面積和比表面 結(jié)果顯示(見(jiàn)表3):模型組中突觸截面積最大,其突觸截面積與治療組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。模型組中突觸比表面最小,其突觸比表面與治療組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),假手術(shù)組與治療組突觸比表面比較尚不認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 13組大鼠行為學(xué)比較結(jié)果(±s,n=10)

表 13組大鼠行為學(xué)比較結(jié)果(±s,n=10)

與模型組相比,*F=4.58、6.24、4.12,P均 ＜0.05

假手術(shù)組模型組治療組12.00±1.4142.50±3.5624.13±2.41*46.45±2.2420.26±1.6838.20±1.26*8.60±1.783.42±1.466.60±1.52*

表2 海馬 CA1區(qū)突觸面數(shù)密度參數(shù)定量分析結(jié)果±s,n=5)

表2 海馬 CA1區(qū)突觸面數(shù)密度參數(shù)定量分析結(jié)果±s,n=5)

與假手術(shù)組相比*P＜0.05;與模型組相比 △P＜0.05

假手術(shù)組模型組治療組32.86±6.3215.25±4.20△30.51±7.26*

表3 海馬CA1區(qū)突觸截面積及比表面定量分析結(jié)果±s,n=5)

表3 海馬CA1區(qū)突觸截面積及比表面定量分析結(jié)果±s,n=5)

與模型組比較*P＜0.05,**P＜0.01

模型組假手術(shù)組治療組0.44±0.150.32±0.10**0.31±0.09*0.0078±0.00300.0087±0.0025*0.0083±0.0022△

3 討 論

突觸是神經(jīng)元之間及神經(jīng)元與效應(yīng)器之間相互接觸并實(shí)現(xiàn)信息傳遞和功能聯(lián)系的部位,突觸的可塑性是學(xué)習(xí)記憶能力改善的物質(zhì)基礎(chǔ),改善海馬突觸可塑性可以增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。阿托伐他汀是第3代他汀類調(diào)脂藥,具有親脂性,可競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成酶系中的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶 A(HMGCOA)還原酶,使膽固醇合成受到限制,臨床中主要通過(guò)調(diào)節(jié)血脂,達(dá)到預(yù)防腦卒中、冠心病、癡呆等的目的。阿托伐他汀可以通過(guò)調(diào)脂及調(diào)脂外作用預(yù)防血管性癡呆的發(fā)生和發(fā)展,已得到大量的大規(guī)模臨床研究證實(shí)。目前,阿托伐他汀調(diào)節(jié)血脂防治癡呆的具體機(jī)制尚不清楚,大多數(shù)研究者認(rèn)為可能是與穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等多重作用有關(guān)。2008年 Kurinami等[6]運(yùn)用注射 β淀粉樣肽(Aβ)的小鼠模型評(píng)估他汀對(duì)于 Aβ介導(dǎo)的認(rèn)知功能損害的作用,認(rèn)為他汀類藥物可以減少Aβ的形成,這也可能是其預(yù)防癡呆的機(jī)制之一。他汀類藥物還可以通過(guò)抑制甲羥戊酸合成來(lái)減少apoE分泌,降低腦內(nèi)細(xì)胞外 apoE水平,從而阻止老年斑的形成,改善認(rèn)知功能[7]。Daimon等[8]研究發(fā)現(xiàn),預(yù)防性使用普伐他汀 14d,短暫性前腦缺血大鼠海馬區(qū)遲發(fā)性死亡神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,而與血漿中膽固醇水平無(wú)明顯相關(guān)。

本研究觀察到大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力有較明顯的提高,這與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致[1]。研究表明阿托伐他汀治療組血管性癡呆海馬 CA1區(qū)Gray1型突觸數(shù)量及突觸小泡的含量顯著增加;突觸截面積減小、比表面增大;突觸結(jié)構(gòu)腫脹變性減輕。阿托伐他汀可能增強(qiáng)大鼠的神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)器細(xì)胞之間的信息傳遞和功能聯(lián)系,促進(jìn)血管性癡呆大鼠的突觸中神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和儲(chǔ)備,使突觸處于更活化狀態(tài),神經(jīng)信息傳遞能力增強(qiáng),從而具有保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)、減輕突觸變性的作用。

軸突漏(axonal leakage)使軸突中神經(jīng)遞質(zhì)等多種成分從軸突漏出,使遠(yuǎn)端軸突突觸營(yíng)養(yǎng)不良和末梢神經(jīng)遞質(zhì)減少。本研究發(fā)現(xiàn)治療組突觸數(shù)量明顯增多、變性減輕、突觸小泡含量增多,分布較均勻,推測(cè)阿托伐他汀有改善軸突漏的功能。另外,我們推測(cè)其可能的機(jī)制主要是:(1)抗炎、抗氧化作用。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在血管性癡呆發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到學(xué)者的重視,也被大量的臨床和基礎(chǔ)研究所證實(shí),在使用阿托伐他汀治療后能降低血漿中 MMP-9、CRP等炎癥因子及 8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OhdG)、MDA的水平[9]。(2)保護(hù)腦血管、增加腦血流量。阿托伐他汀可以穩(wěn)定血管斑塊、上調(diào)擴(kuò)血管因子的含量和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、增加血管樣結(jié)構(gòu)的形成,特別是促進(jìn)損傷區(qū)邊緣和海馬 CA1區(qū)的新生血管發(fā)生,這能明顯減輕神經(jīng)血管功能的損傷,增強(qiáng)受損神經(jīng)元細(xì)胞的存活能力和恢復(fù)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀治療組突觸腫脹變性明顯減輕,這可能與抗炎、抗氧化作用及保護(hù)腦血管、增加腦血流量有關(guān)。

綜上所述,阿托伐他汀可通過(guò)多種不同的靶點(diǎn)治療血管性癡呆,其安全、療效較好,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。其保護(hù)機(jī)制可能涉及多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶位的作用,有待深入研究及探討。

圖1 大鼠海馬區(qū) HE染色

圖2 大鼠海馬區(qū)電鏡超微結(jié)構(gòu)

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