米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用

熊建忠, 陸兵勛

缺血性腦卒中的致死及致殘率非常高,對(duì)于缺血性腦卒中目前缺乏有效的治療方法?？寡“逯委煴徽J(rèn)為是一種有效預(yù)防卒中的方法,對(duì)于急性缺血性腦卒中,靜脈溶栓是目前唯一被證明有效的方法,但只能使部分患者獲利[1]。最近的研究顯示,腦梗死后的炎癥反應(yīng)對(duì)腦卒中的預(yù)后有很大的影響。米諾環(huán)素(Minocycline,MC)是半合成第二代四環(huán)素類抗生素,目前發(fā)現(xiàn)它除了具有抗菌作用之外,還具有很強(qiáng)的抗炎作用[2]。本研究將通過給腦缺血再灌大鼠腹腔注射米諾環(huán)素,了解米諾環(huán)素對(duì)缺血再灌注后環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、細(xì)胞凋亡,腦缺血體積的影響。為米諾環(huán)素治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 選擇健康成年雄性 SD大鼠48只 (中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供),體重 (250～300g),隨機(jī)分為 4組,每組 12只,即假手術(shù)組(術(shù)后30min,腹腔注射米諾環(huán)素 45mg/kg;生理鹽水組(大鼠缺血后 30min,腹腔注射等量生理鹽水);治療組(大鼠缺血后 30min,腹腔注射米諾環(huán)素 45mg/kg);預(yù)處理組 (大鼠缺血前 12h腹腔注射米諾環(huán)素45mg/kg)。

1.2 模型的制備 采用改良的 ZeaLonga線栓法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞再通 (MCAO)模型,于缺血 1.5h后撥出線栓,形成腦缺血再灌注。假手術(shù)組(線栓插入深度為 10cm,不造成腦缺血)其余處理相同。

1.3 MRI檢查 使用 GE 1.5T超導(dǎo)型磁共振成像系統(tǒng),3英寸表面線圈,行冠狀位 T2WI系列掃描。T2WI掃描參數(shù)(TR/TE/NEX4200/94/6)層厚 3mm,層間隔 0mm,FOV8cm×8cm,矩陣 256×256。利用體積分析軟件測(cè)出病變體積(LV)及缺血側(cè)半球體積(HVi),對(duì)側(cè)半球體積(HVc)。校正后缺血病變體積比 =(HVc-HV i+LV)/HVc×100[3]。

1.4 COX-2免疫組織化學(xué)染色 大鼠缺血再灌注24h后,用 10%水合氯醛麻醉,等滲生理鹽水和4%多聚甲醛 PBS液進(jìn)行心臟灌注,斷頭取腦,取距嗅球尖端后 7～11mm間的腦組織塊,置于 4%多聚甲醛中固定,脫水,包埋,連續(xù)切片,片厚 6μm。免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行。染色成功后用高倍顯微鏡進(jìn)行拍照,每張切片選取 5個(gè)視野,采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析光密度值。

1.5 前列腺素 E2水平測(cè)定 大鼠麻醉后用等滲生理鹽水快速灌洗,斷頭取患側(cè)腦組織,分離額頂部皮質(zhì),置微型勻漿器中加 0.1ml無水乙醇研磨,再加等滲生理鹽水 0.9ml充分研磨成勻漿,4℃離心3500r/min,15min,取勻漿上清液 200μl,按放免試劑盒說明操作,測(cè)出樣品溶度。

1.6 Hoechst染色 切片常規(guī)脫臘透明后,置于 6孔板上以 0.9%生理鹽水洗 3遍,每次 3min,吸盡液體,然后加入 0.5ml的 Hoechst染色液,手搖晃動(dòng)以充分染色,染色 5min,完成后將切片置于載玻片上,滴上 1滴抗淬滅液,蓋上潔凈的蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡形態(tài)。用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照,結(jié)果用 Image-Pro Plus 6.0計(jì)算各區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s)表示 ,數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析檢測(cè),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,假手術(shù)組腦組織僅有少量凋亡細(xì)胞及少量 COX-2陽(yáng)性細(xì)胞,PGE2在假手術(shù)組表達(dá)很低。生理鹽水組細(xì)胞凋亡率,PGE2水平明顯升高,COX-2強(qiáng)烈表達(dá),與假手術(shù)組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),生理鹽水組 T2WI檢測(cè)可見缺血側(cè)大片高信號(hào)強(qiáng)度區(qū)。米諾環(huán)素預(yù)處理組和治療組與生理鹽水組相比,細(xì)胞凋亡率、PGE2水平明顯下降,腦缺血體積縮小,COX-2光密度降低差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),結(jié)果(見表1、表2;見圖1～圖8)。

表1 各組大鼠腦缺血體積及細(xì)胞凋亡率(%)

表2 各組大鼠 COX-2光密度值及 PGE2水平

3 討 論

缺血性腦血管病的致死、致殘率非常高。目前是僅次于心臟病和癌癥之后的第 3位致死原因。最近研究顯示,腦梗死后的炎性反應(yīng)對(duì)腦卒中的預(yù)后有很大的影響[4]。腦梗死后炎性因子包括環(huán)氧化酶2、前列腺素 E2、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等。COX-2、PGE2參與了腦缺血后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展,并與腦缺血的預(yù)后關(guān)系密切。Kinoshita等研究顯示,腦缺血 90min后或大腦中動(dòng)脈永久閉塞,COX-2在半暗帶和鄰近皮質(zhì)區(qū)表達(dá)強(qiáng)烈[5]。環(huán)氧化酶是催化花生四烯酸生成前列腺和血栓素的限速酶。COX-2為誘導(dǎo)型,在大多數(shù)組織中檢測(cè)不到[6]。米諾環(huán)素是一種半合成的第 2代四環(huán)素衍生物 ,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及革蘭氏陰性球菌等都有較好的抗菌作用[7]。最近研究表明米諾環(huán)素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神經(jīng)保護(hù)作用[8]。本組數(shù)據(jù)顯示生理鹽水組COX-2、PGE2的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多,米諾環(huán)素組治療組和預(yù)處理組能明顯降低 COX-2、PGE2的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果與 Kim等結(jié)果相似[9]。目前認(rèn)為米諾環(huán)素降低缺血后 COX-2,PGE2的表達(dá),是通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、減少一氧化氮的產(chǎn)生、抑制還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性、抑制P38促分裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化等途徑,抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活與增殖而起作用的[10]。

腦缺血后神經(jīng)元的死亡包括壞死和凋亡過程。在腦缺血急性期,神經(jīng)元壞死和凋亡并存,細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū),細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶區(qū)[11]。凋亡可能決定了最終梗死體積。本組數(shù)據(jù)顯示,米諾環(huán)素預(yù)處理組和米諾環(huán)素治療組、大鼠腦缺血的體積、凋亡細(xì)胞率較生理鹽水組減少。米諾環(huán)素抗細(xì)胞凋亡作用與其對(duì)半胱氨酸蛋白酶Caspase-1和 Caspase-3的抑制[12],阻止細(xì)胞色素 C和促凋亡蛋白(Smac/DIABLO)的釋放,上調(diào)抗凋亡因子 bcl-2等作用有關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了米諾環(huán)素的抗凋亡作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明腦缺血再灌注后 COX-2、PGE2增加,細(xì)胞凋亡率增加,而米諾環(huán)素能明顯減少 COX-2、PGE2的表達(dá),及缺血半暗帶的細(xì)胞凋亡率,對(duì)腦缺血再灌注損傷有腦保護(hù)作用。米諾環(huán)素是第 2代四環(huán)素類抗生素,多項(xiàng)研究表明其在腦缺血[14]、肌萎縮性 (脊髓 )側(cè)索硬化[15]及帕金森病等疾病的發(fā)生過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而,現(xiàn)今對(duì)于米諾環(huán)素的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,其在臨床上的神經(jīng)保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

圖1 假手術(shù)組

圖2 生理鹽水

圖3 預(yù)處理組

圖4 30min組

圖5 假手術(shù)組

圖6 生理鹽水組

圖7 預(yù)處理組

圖8 30min

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