鉀通道 Kv1.2與致癇大鼠發(fā)病相關(guān)性的研究

曾常茜, 李冬平, 唐 偉, 王 葳, 曹平安, 鄒颯楓

癲癇是一組由多種病因引起的以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性臨床綜合征。現(xiàn)已證明大多數(shù)遺傳性特發(fā)性癲癇與離子通道基因突變有關(guān)。鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性方面起著重要的作用,其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞膜盡快恢復(fù)靜息狀態(tài),控制細(xì)胞的興奮性水平和放電頻率。鉀通道 Kv1.2是瞬時外向鉀通道,其特點(diǎn)是去極化時通道暫時開放,產(chǎn)生短暫外向電流即 IA電流。IA電流是動作電位復(fù)極化早期外向電流的主要成分,當(dāng) A型鉀通道異常失活時,常導(dǎo)致動作電位長時程延長。鉀通道 Kv1.2與癲癇發(fā)病機(jī)制的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗通過檢測戊四唑致癇大鼠海馬區(qū)鉀通道 Kv1.2蛋白表達(dá),探討鉀通道Kv1.2與癲癇發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠 40只(10周齡、體重220±20克)由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。兔抗鼠 Kv1.2單克隆抗體購自alomone公司,β-actin內(nèi)參蛋白購自上海碩盟,生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體、SP試劑和 DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司;Marker購自 Cell Signaling Technology公司;戊四唑 (PTZ)購自 Sigma公司;NP-40、SDS、PMSF、BSA、丙烯酰胺、Tris堿 、TEMED、過硫酸胺、澳酚藍(lán) 、甘氨酸、DTT、考馬斯亮藍(lán) R-250,均為 Amresco公司產(chǎn)品。POWERLAB電生理記錄儀(ADinstruments/澳大利亞);DU640紫外分光光度計(BECKMAN);蛋白電轉(zhuǎn)儀、垂直電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型的制作 SD雄性大鼠 40只分成實(shí)驗組 30只,對照組 10只。對 30只實(shí)驗組大鼠,首先給予大鼠腹腔注射 1%PTZ溶液 40mg/kg,10min后注射 20mg/kg,然后每 10min注射 10mg/kg。大鼠驚厥的行為表現(xiàn)采用 Racine 6級評價標(biāo)準(zhǔn):0級,無任何反應(yīng);I級,濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須及節(jié)律性咀嚼;Ⅱ級,頸部肌肉痙攣,表現(xiàn)為點(diǎn)頭和(或)甩尾;Ⅲ級,一側(cè)前肢陣攣;Ⅳ級,雙側(cè)前肢陣攣伴站立;V級,全身陣攣,失去平衡,跌倒。當(dāng)大鼠達(dá) 4～5級、重復(fù)的驚厥發(fā)作達(dá)10min以上以及腦電監(jiān)測為尖波、慢波、尖慢復(fù)合波時認(rèn)定大鼠致癇成功,分別在 1h、24h、48h時間段取材進(jìn)行以下實(shí)驗。

1.2.2 腦電的引導(dǎo)與分析 從實(shí)驗組中隨機(jī)抽取 6只、從對照組中隨意抽取 2只大鼠行腦電監(jiān)測。電極安裝在右額及右枕(右額坐標(biāo)為:前囟前3.0mm,中線旁 2.0mm,硬膜下 0.5mm;右枕坐標(biāo)為:前囟后 5.8mm,中線旁 3.0mm,硬膜下 0.5mm)。通過 powerlab生理記錄儀進(jìn)行腦電記錄,參數(shù):高通0.03s,低通 30Hz,量程 500μv～3mv。在注射前后監(jiān)測 EEG,每 5min記錄一次至 150min。通過對腦電圖的形態(tài)、頻率、波幅進(jìn)行癇樣放電的判斷。

1.2.3 分組 實(shí)驗組共 30只,成功致癇后在1h、24h、48h時間段各取 8只大鼠腦組織行電壓門控鉀通道 Kv1.2檢測。對照組共 10只,隨機(jī)抽取 8只正常大鼠腦組織行電壓門控鉀通道 Kv1.2檢測。

1.2.4 腦片制作及組織凍存 大鼠在 10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉下,經(jīng)左心室灌注生理鹽水 150ml,隨后灌注含 4%多聚甲醛 0.1mol/L PB(p H7.4,4℃)300ml。取出大腦,將腦組織分成兩半。一半用 4%多聚甲醛固定 24h,4℃。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。約位于海馬區(qū)層面連續(xù)冠狀切片,厚 3μm,每隔 5片取 2片,行免疫組化染色。另一半分離出海馬并迅速放置于液氮罐中低溫保存,以備行 Western Blot檢測。

1.2.5 免疫組化染色檢測鉀通道 Kv1.2的表達(dá) 鉀通道 Kv1.2抗原表達(dá)檢測采用 ABC染色方法:各組大鼠做石蠟切片后常規(guī)脫蠟,微波修復(fù)抗原,自然涼至室溫。抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性后,用山羊免疫正常血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),室溫孵育 30min。加兔抗鼠 Kv1.2單克隆抗體 (1∶200),4℃過夜。PBS洗滌,5min×3次。加生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體,37℃1h后,PBS洗滌,5min×3次。滴加 SP試劑,室溫作用 20min,PBS洗滌,5mim×3次。加 DAB顯色 2min后,用蘇木精復(fù)染1min。脫水、透明,中性樹膠封片。顯微鏡下(×400)觀察結(jié)果。用 Image pro plus圖像分析軟件測定海馬 CA1、CA3、齒狀回(DG)Kv1.2蛋白表達(dá)的平均光密度(IOD/area),并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6 Western Blot檢測鉀通道 Kv1.2蛋白水平用 RIPA裂解液提取腦組織全細(xì)胞蛋白、紫外光分光光度計測定蛋白濃度及計算上樣量;在 100℃水浴中煮5 min使蛋白充分變性;用蛋白垂直電泳儀進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;利用蛋白電轉(zhuǎn)儀裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;NC膜放入封閉液中 4°C過夜;在 NC膜上均勻加入抗鼠 Kv1.2單克隆抗體(1∶200),37℃孵育 1h,用TTBS洗去未結(jié)合的一抗;在 NC膜上均勻滴入生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體,37℃孵育 1h,TTBS洗 3×10min;加入辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液,37℃孵育1h,TTBS洗 3×10min;滴加 DAB液,避光顯色。用Lannch Doc-Itis軟件對圖片條帶行光密度測定,取各條帶累積光密度(IOD)與相對應(yīng)的 β-actin內(nèi)參蛋白 IOD之比,即 Kv1.2蛋白的相對量作統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用 SSPS 11.5軟件對免疫組化檢測電壓門控鉀通道 Kv1.2蛋白表達(dá)的平均光密度進(jìn)行方差分析和 LSD檢驗。Kv1.2蛋白表達(dá)的IOD與 β-actin蛋白的 IOD比值作為蛋白表達(dá)相對量,對此進(jìn)行方差分析和 LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 癇樣行為及腦電圖檢測結(jié)果 實(shí)驗組 30只大鼠均于 2次注射 PTZ 20mg/kg后出現(xiàn)抖動、動須、點(diǎn)頭及節(jié)律性咀嚼,然后每 10min注射 10mg/kg 1～2次后,27只大鼠出現(xiàn)全身陣攣、角弓反張、四肢強(qiáng)直、跌倒,達(dá)到 Racine標(biāo)準(zhǔn) 4～5級,持續(xù)約 10～20min后逐漸停止抽搐。在大鼠抽搐發(fā)作中,腦電圖明顯異常,表現(xiàn)為大量的高尖波及尖慢復(fù)合波,節(jié)律不規(guī)則,平均波幅 120μV最大波幅達(dá) 260μV,頻率達(dá) 30Hz。隨著大鼠抽搐的停止,高尖波及尖慢波逐漸減少,波幅下降,直至停止監(jiān)測仍有散在尖波。另外 3只大鼠均無全身痙攣出現(xiàn),未達(dá)到 Racine標(biāo)準(zhǔn) 4～5級,剔除出實(shí)驗組。對照組大鼠腦電圖呈細(xì)小 α波,波幅較均一,最大波幅 ＜10,頻率 8Hz(見圖1)。

圖1 實(shí)驗組與對照組大鼠腦電圖檢測結(jié)果

2.2 大鼠 Kv1.2蛋白表達(dá)結(jié)果 Kv1.2蛋白在對照組和實(shí)驗組大鼠海馬均有分布,以錐體細(xì)胞層、齒狀回顆粒細(xì)胞層為主。高倍鏡下可見陽性細(xì)胞一般為梭形或星形,胞漿及細(xì)胞膜上有棕黃色陽性反應(yīng)顆粒,以 CA3區(qū)最為明顯。各時間段(1h、24h、48h)的實(shí)驗組大鼠海馬陽性細(xì)胞數(shù)均較對照組少,陽性細(xì)胞著色較淺,少有突起,未見明顯膠質(zhì)細(xì)胞增生。各時間段(1h、24h、48h)的實(shí)驗組大鼠海馬 CA1、CA3、DG區(qū)的平均光密度值均較對照組顯著減少(P＜0.05);實(shí)驗組 3個時間段(1h、24h、48h)的各海馬區(qū)平均光密度值無顯著性差異(P＞0.05)(見表1)(見圖2～圖4)。

2.3 大鼠 Kv1.2蛋白相對濃度的檢測結(jié)果在 57kd處有明顯的蛋白條帶。對照組與各實(shí)驗組相比蛋白條帶明顯寬厚,而各實(shí)驗組蛋白條帶之間基本相同。42kd處內(nèi)參蛋白條帶在對照組與各實(shí)驗組之間基本相同。結(jié)果提示,海馬神經(jīng)元有 Kv 1.2表達(dá),實(shí)驗組大鼠海馬區(qū) Kv1.2表達(dá)下降,這與免疫組化染色檢測的結(jié)果一致。致癇后 1h、24h、48h大鼠海馬區(qū) Kv1.2蛋白相對濃度與對照組相對濃度均有明顯差異(P＜0.01)(見表2)。

表1 免疫組化法檢測 Kv1.2蛋白表達(dá)結(jié)果

表2 Western blot檢測大鼠海馬 Kv1.2蛋白結(jié)果

3 討 論

癲癇的功能失常可表現(xiàn)為運(yùn)動、感覺、意識、行為、自主神經(jīng)功能等不同障礙。神經(jīng)元靜息電位的維持,動作電位的發(fā)生、發(fā)展均與鉀離子在細(xì)胞內(nèi)外正常分布密切相關(guān)。當(dāng)鉀離子分布發(fā)生異常改變時,常伴發(fā)腦電生理中陣發(fā)性去極化飄移,神經(jīng)元出現(xiàn)異常電生理活動。在動物癲癇和癲癇性發(fā)作模型中,發(fā)現(xiàn)在發(fā)作前或發(fā)作中細(xì)胞外鉀離子濃度均有升高。鉀離子分布主要通過鉀離子通道途徑來調(diào)節(jié),鉀通道開放時促進(jìn) K+外流,引起細(xì)胞膜復(fù)極化和超極化,從而降低細(xì)胞的興奮性。因此鉀離子通道功能的改變是引起神經(jīng)元內(nèi)在興奮性不平衡的物質(zhì)基礎(chǔ),癲癇的發(fā)病機(jī)制與電壓門控鉀離子通道密切相關(guān)。

神經(jīng)元的活動、信息傳遞無不通過動作電位來完成,動作電位發(fā)放的調(diào)節(jié)主要是通過電壓門控鉀離子通道外向電流來實(shí)現(xiàn)。在神經(jīng)細(xì)胞從超極化向去極化閾電位過度時首先受到電壓門控鉀通道 Kir2抑制性調(diào)節(jié),隨著電位向閾電位的上升,Kir2鉀通道逐漸失活關(guān)閉[1,2]。當(dāng)電壓接近 -60mV時另一電壓門控鉀通道被激活,對神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)突觸的去極化進(jìn)行抑制調(diào)節(jié)作用。這種鉀通道在低于閾電位時開始被激活,Bekkers等[3]對此類通道進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)及門控特性的研究,認(rèn)定其為 Kv1型鉀通道。與神經(jīng)細(xì)胞異常放電密切相關(guān)的癲癇是否會因 Kv1通道功能異常引發(fā)很值得探討。

戊四唑能引起動物抽搐迅速發(fā)生,短時間內(nèi)達(dá)到高峰,持續(xù)較短時間后自動停止,因此戊四唑被認(rèn)為是復(fù)制急性全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作癲癇模型的理想藥物。本實(shí)驗通過對大鼠腹腔注射戊四唑建立了癲癇的急性全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作癲癇模型,在此模型上對 3組不同時間致癇大鼠海馬 CA1、CA3、DG區(qū)鉀通道 Kv1.2進(jìn)行檢測并與對照組大鼠比較,結(jié)果表明:致癇組大鼠海馬區(qū)鉀通道 Kv1.2蛋白表達(dá)水平在致癇后 3個時間段(1h、24h、48h)均明顯低于對照組(P＜0.05)。各致癇組大鼠海馬區(qū)鉀通道 Kv1.2蛋白表達(dá)水平在致癇后3個時間段(1h、24h、48h)之間均無明顯差異(P＞0.05)。因此認(rèn)為大鼠海馬區(qū)鉀通道 Kv1.2表達(dá)的減少與全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作大鼠癲癇發(fā)病密切相關(guān)。這與 Tsaur[4]在實(shí)驗中檢測到致癇鼠海馬區(qū) Kv1.2 mRNAs表達(dá)明顯減少相一致。而致癇大鼠在 48h之內(nèi)鉀通道 Kv1.2的表達(dá)并無明顯差異,推測在此時間段神經(jīng)元內(nèi)鉀通道蛋白合成仍未完全恢復(fù)。在實(shí)驗組和對照組大鼠海馬區(qū)均可見陽性細(xì)胞表達(dá),主要集中于海馬顆粒細(xì)胞層,顆粒細(xì)胞層細(xì)胞異常放電可能是大鼠癲癇發(fā)作的主要因素。這與 Park等[5]實(shí)驗發(fā)現(xiàn)戊四唑致癇鼠 Kv1.2免疫反應(yīng)異常增強(qiáng)主要位于海馬顆粒細(xì)胞層的結(jié)果相一致。

電壓門控鉀通道亞家族 Shaker(Kv1.1-Kv1.8)為四聚體通道,由 Kcna1-Kcna 8基因編碼,其中編碼Kv1.1、Kv 1.2的基因具有最高同源性。 Kv1.1、Kv1.2兩通道的四聚體構(gòu)成基本相同,因此功能上也表現(xiàn)為很多的相同性。這兩種鉀通道共同表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),通過該通道的鉀離子形成一瞬時外向性鉀電流即 A-型鉀電流(IA)。這種鉀通道在低于閾電位時開始被激活,產(chǎn)生外向 IA并抵消刺激電流,去極化幾乎被抑制,延長,膜電位去極化。動作電位的時程決定功能依賴性鈣的進(jìn)入并調(diào)節(jié)鈣依賴的后續(xù)進(jìn)程,增加 Ca2+內(nèi)流入神經(jīng)末端,觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放并介導(dǎo)興奮性突觸后電位,增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性。因此 A通道作為一個阻尼器,在動作電位之間插入一個間歇時間,動作電位峰峰間隔延長,使重復(fù)爆發(fā)性放電變成緩慢放電,調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的復(fù)極化,降低膜的興奮性。有外國學(xué)者 Shen[6]等對此類鉀通道進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)及門控特性的研究時發(fā)現(xiàn),雖然 Kv1.1、Kv1.2和 Kv1.6 mRNA在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá),但藥理學(xué)上表明此類通道主要是由 Kv1.2構(gòu)成。在閾下鉀電流中通過 Kv1.2的鉀電流占有近一半。因此作者認(rèn)為 Kv1.1,Kv1.2雖均參于復(fù)極化電位調(diào)節(jié),但 Kv1.2是影響鋒電位閾值以及重復(fù)放電的主要機(jī)制,因而鉀通道 Kv1.2表達(dá)的減少必然增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性并引發(fā)癲癇。鉀通道 Kv1.2由 α核心亞基及 β輔助亞基組成,除了其核心亞基表達(dá)減少可引起癲癇外,Connor[7]發(fā)現(xiàn)刪除編碼 β輔助亞基基因同樣可引發(fā)大鼠抽搐。通過本實(shí)驗我們更深一步地認(rèn)識到電壓門控鉀通道 Kv1.2功能的異常是全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作癲癇的重要發(fā)病機(jī)制,這為開發(fā)新的治療癲癇藥物-鉀通道 Kv1.2開放劑,提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗依據(jù)。

圖2 大鼠海馬齒狀回 Kv 1.2的表達(dá)(免疫組化法,40×)

圖3 大鼠海馬CA 1區(qū) Kv1.2的表達(dá)(免疫組化法,200×)

圖4 大鼠海馬 CA 3區(qū) Kv1.2的表達(dá)(免疫組化法,400×)

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