GRIN2B近似啟動子區(qū)多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病相關(guān)性分析

江漢秋, 張曉君, 劉 瑾, 馬中華, 賈建平

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以記憶力明顯下降為主要表現(xiàn)的進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。大腦皮質(zhì)及海馬的突觸減少被認為是 AD早期認知損害的主要原因[1,2]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體是位于突觸后膜的離子型谷氨酸受體的一個亞型。在生理條件下,NMDA受體通過與谷氨酸結(jié)合,使 Ca2+通道開放,從而促進突觸的傳遞、誘發(fā)長時程增強,而這些都與學習和記憶非常相關(guān)[3]。

近年來有研究發(fā)現(xiàn),AD腦內(nèi)在一些敏感區(qū)域的NMDA受體亞基轉(zhuǎn)錄及蛋白水平下降,尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸受體 2B(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NR2B)水平下降尤為突出[4,5]。本課題組在之前的研究中已經(jīng)篩查了中國北方漢族人群GRIN2B基因近似啟動子區(qū)(-1621bp至 +177bp)的變異位點,并發(fā)現(xiàn)-421C/A多態(tài)性與AD發(fā)病有明顯的相關(guān)性。故本研究繼續(xù)研究啟動子區(qū)(-2454bp至-1269bp)多態(tài)性,進一步從遺傳學角度闡述其與SAD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 共 362例散發(fā)性阿爾茨海默病(sporadic Alzheimer's disease,SAD)患者,男 165例,女 197例,平均年齡 70.4±6.8歲。均為 2000年 ～2007年來自首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院、北京市老年病醫(yī)院、北京市 10余家老人院的患者。所有患者均進行簡易精神狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)評分和 Hachinski缺血評分。采用美國國立神經(jīng)病、語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)臨床診斷標準,把診斷為“很可能 AD”的患者列為研究對象。對照組共 334例健康老年人,男 142例,女 192例,平均年齡 68.4±8.1歲。均為 2000年 ～2007年間宣武醫(yī)院門診及秦皇島海港區(qū)退休人員體檢者,且均經(jīng) MMSE評分、Hachinski缺血評分和門診系統(tǒng)體檢證實為健康人。

1.2 基因組 DNA提取 全部研究對象采集清晨空腹外周靜脈血 5ml,構(gòu)椽酸鈉抗凝,常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組 DNA。

1.3 GRIN2B啟動子區(qū)變異位點篩查

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù) NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)及 Miyatake等研究[6]中提供的資料,在 GRIN2B近似啟動子區(qū)用 Primer Premier 5設(shè)計引物(見表1)。

1.3.2 PCR擴增 隨機選取 25例 SAD患者和 25名正常對照者的 DNA標本,用標準 PCR方法擴增 GRIN2B基因近似啟動子區(qū),其位于相對轉(zhuǎn)錄起始點(transcription start site,TSS)-2454bp至-1269bp區(qū)域。PCR反應體系:DDH2O 9.6μl,2×緩沖液 12.5μl,dNTP(10mmol)0.8μl,上 、下游引物(10pmol/μl)各 0.5μl,LA Taq酶 (5U/μl)0.1μl,DNA模板 1.0μl。反應條件:94℃預變性 5min,94℃30s,65℃30s,72℃1min 50s,共 30個循環(huán),72℃再延伸7min。

1.3.3 直接測序 用直接測序的方法系統(tǒng)篩查 GRIN2B啟動子區(qū)變異位點(共 1186bp)。

1.4 多態(tài)性分型

1.4.1 引物設(shè)計 用 Primer Premier 5設(shè)計引物,分別擴增各相應片段(見表1)。

1.4.2 PCR擴增 對所有樣本均進行相應片段的 PCR擴增。PCR反應體系均為:DDH2O 10.0 μl,2 ×緩沖液 12.5μl,dNTP(10mmol)0.4μl,上、下游引物 (10pmol/μl)各 0.5μl,LA Taq酶 (5U/μl)0.1μl,DNA模板 1.0μl。反應條件:94℃預變性5min,94℃30s,55℃30s(-1887 A/G和-2315 A/G位點均為 54℃),72℃30s,共 35個循環(huán),72℃再延伸5min。

1.4.3 限制性內(nèi)切酶消化和電泳(見表2)。

1.5 統(tǒng)計學處理 通過 SHEsis檢測每組各多態(tài)性的分布是否符合 Hardy-Weinberg(HW)平衡(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)[7]。等位基因和基因型頻率在患者和對照組中的分布差別均用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行卡方檢驗。與疾病的關(guān)聯(lián)強度用比值比(Odds Ratio,OR)和 95%可信區(qū)間(95%confidence intervals,95%CI)表示。用Logistic回歸校正年齡、性別和 APOE狀態(tài)。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 GRIN2B近似啟動子區(qū)變異位點篩查 我們對隨機選取的 25名 SAD患者和 25名正常對照者的 GRIN2B近似啟動子區(qū)-2454bp至-1269bp片段進行直接測序發(fā)現(xiàn)存在4個多態(tài)性位點,除之前發(fā)現(xiàn)的-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476)外[8],還 有-1887A/G(rs10845866)和-2315A/G(rs10845867)兩個多態(tài)性位點。

2.2 GRIN2B近似啟動子區(qū)-1887A/G、-2315A/G多態(tài)性位點的遺傳學分析。

2.2.1 分型依據(jù)(見表3)。

2.2.2 遺傳學統(tǒng)計分析 每個多態(tài)性位點在人群中的基因型和等位基因分布均符合 HW平衡。-1887A/G和-2315A/G多態(tài)性位點的基因型頻率和等位基因頻率在 SAD和正常對照組中均無顯著性差異,其中基因型分布 P=0.841和 P=0.298,等位基因頻率 P=0.605和 P=0.409。在不攜帶APOEε4的人群中,-1887A/G和-2315A/G多態(tài)性位點的基因型頻率和等位基因頻率在SAD和正常對照組同樣無顯著性差異,其中基因型分布 P=0.733和 P=0.665,等位基因頻率 P=0.738和 P=0.686;在攜帶 APOEε4的人群中,他們的分布仍然沒有不同。此外,我們通過 Logistic回歸(見表4),并沒有發(fā)現(xiàn)這兩個多態(tài)性位點的 AA基因型可增加或減少 AD的發(fā)病。

表1 GRIN2B近似啟動子區(qū)多態(tài)性篩查所需引物及PCR產(chǎn)物片段長度

表2 GRIN2B啟動子區(qū)多態(tài)性限制性內(nèi)切酶消化片段長度及電泳條件

表 31887和-2315多態(tài)性位點基因型及等位基因在AD與正常人中的分布及比較

表 41887和-2315多態(tài)性與AD疾病危險度的相關(guān)分析

3 討 論

目前,基因多態(tài)性與 AD發(fā)病相關(guān)聯(lián)的觀點已逐步被接受。最近的一些研究焦點已不僅僅集中在基因的外顯子或者內(nèi)含子上,而且也包括了基因的其它調(diào)控區(qū)。越來越多的研究顯示,某些基因的啟動子區(qū)多態(tài)性可能與 SAD的發(fā)病風險有關(guān)。關(guān)于GRIN2B基因與 AD少有研究,Tsai等[9]研究了NR2B亞基 2664T/C多態(tài)性與 AD的關(guān)系,但其檢測的 132例 AD患者基因型及等位基因頻率與 114例正常人沒有顯著差異,該變異可能屬于沉默變異,并沒有改變氨基酸序列。最近,Seripa等人[10]對高加索人 222例 AD患者和 170正常健康人的研究中,發(fā)現(xiàn) GRIN2B啟動子區(qū)的-200T/G位點、第 13外顯子的 2664T/C位點和 3'UTR的 5073G/T位點的基因型及等位基因頻率與 AD的發(fā)病無關(guān),然而通過單體型分析發(fā)現(xiàn)-200G2664C5073T單體型可增加 AD的發(fā)病風險。

本課題組之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了中國北方漢族人群中 GRIN2B啟動子區(qū)存在-200T/G(rs1019385)、-421C/A(rs3764028)、-1447T/C(ENS10557853)和-1497G/A(rs12368476)多態(tài)性位點,其中-421C/A多態(tài)性與 AD的發(fā)病有明顯的相關(guān)性。為此,本研究繼續(xù)探討了 GRIN2B近似啟動子區(qū)其他多態(tài)性位點與 AD的發(fā)病關(guān)系。然而,所發(fā)現(xiàn)的-1887A/G和-2315A/G多態(tài)性位點無論是基因型還是等位基因頻率均和 AD的發(fā)病無關(guān)。在APOEε4分層中,無論是否攜帶 APOEε4,其基因型及等位基因頻率仍然與 AD的發(fā)病無明顯相關(guān)。

國內(nèi)外學者關(guān)于 GRIN2B啟動子區(qū)變異與疾病(如:精神分裂癥、亨廷頓舞蹈病、酒精中毒等)相關(guān)性的研究除本研究之前發(fā)現(xiàn)的-421C/A多態(tài)性與AD發(fā)病有關(guān)外,其他主要集中在-200T/G位點上[11～13]。到目前為 止,只有 Seripa等人[10]對GRIN2B啟動子區(qū)多態(tài)性位點與 SAD的發(fā)病關(guān)系進行了研究,且只研究了-200T/G這一個啟動子區(qū)多態(tài)性位點,結(jié)果表明在高加索人群中,該多態(tài)性位點與 SAD的發(fā)病不相關(guān),但與其他位點的單體型可能與 AD發(fā)病有關(guān)。本研究進一步的啟動子上游堿基多態(tài)性位點的篩查中,也未發(fā)現(xiàn)與 AD相關(guān)的其他多態(tài)性位點。為此,我們認為在今后的研究工作中進一步擴大樣本量或者另外去探尋中國北方漢族人群編碼區(qū)或 3'UTR的多態(tài)性位點,才有可能發(fā)現(xiàn)有意義的單體型,從而明確 GRIN2B基因變異在 SAD發(fā)病中的作用。

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