慢性前腦缺血致癡呆大鼠 IL-1β、IL-6及 TNF-α的研究

金 濤, 吳 江, 鄒昕穎, 張海寧, 孫 莉

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是老年期癡呆的重要類型。以往認(rèn)為血管性癡呆是腦梗死所致。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn):慢性腦灌注不足尤其是皮質(zhì)下白質(zhì)腦血流量慢性持續(xù)性下降可能是導(dǎo)致血管性癡呆的主要原因之一,故慢性缺血在 VD發(fā)病機(jī)制中所起的作用開(kāi)始引起人們關(guān)注。在前期工作中,我們采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法成功制備了慢性前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?應(yīng)用激光多普勒血流儀檢測(cè)了各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)額葉、頂葉、海馬及皮質(zhì)下區(qū)局部腦血流量,利用 Morris水迷宮法檢測(cè)各組大鼠的記憶功能,結(jié)果顯示雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)慢性持續(xù)性腦血流量下降及持續(xù)性認(rèn)知功能障礙,說(shuō)明我們的慢性缺血致血管性癡呆大鼠造模成功[1]。長(zhǎng)期以來(lái),免疫炎癥反應(yīng)作為腦缺血損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的一環(huán)一直倍受人們的關(guān)注。其中,IL-1β、IL-6及 TNF-α被視為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血相關(guān)的最主要炎癥反應(yīng)分子。至今,人們對(duì) IL-1β、IL-6及 TNF-α在缺血方面的研究多集中在急性腦缺血尤其是短暫腦缺血后再灌注方面[2～4],而在慢性腦缺血方面研究甚少,有關(guān)慢性腦缺血致血管性癡呆大鼠 IL-1β、IL-6及 TNF-α經(jīng)時(shí)變化的基礎(chǔ)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上,采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法制備慢性前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癡呆大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)中炎性因子 IL-1β、IL-6及 TNF-α的經(jīng)時(shí)變化,以期闡明 IL-1β、IL-6及 TNF-α在慢性腦缺血致血管性癡呆發(fā)病機(jī)制中的作用,為臨床上防治血管性癡呆提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制備 選用長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供的健康雄性 Wistar大鼠 150只,鼠齡 3～5個(gè)月,體重 300～350g。隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組又分為手術(shù)后 24h組、1w組、半個(gè)月組、1個(gè)月組、2個(gè)月組、3個(gè)月組及 4個(gè)月組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法制備慢性前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?具體方法如下:大鼠術(shù)前 12h禁食,4h禁水。用 1%戊巴比妥鈉(10mg/kg)腹腔注射麻醉,保證手術(shù)期間有自主呼吸。仰臥固定,頸部去毛、強(qiáng)力碘消毒后沿頸正中切開(kāi),分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,并套以“0”號(hào)線。分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)近端,并從中間剪斷,以確保阻斷動(dòng)脈血流。術(shù)中大鼠肛溫保持在 36.5℃ ～37.5℃,手術(shù)后動(dòng)物送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動(dòng)物房飼養(yǎng)。對(duì)照組(假手術(shù)組)除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈外,其余過(guò)程與手術(shù)組相同。

1.2 行為學(xué)檢測(cè) 采用 Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠記憶功能的測(cè)定[1]。

1.3 腦血流量測(cè)定 應(yīng)用瑞典 Perimed AB公司生產(chǎn)的 PeriFlux System 5000型激光多普勒血流儀(LDP)檢測(cè)各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后 24h、1w、半個(gè)月 、1個(gè)月 、2個(gè)月 、3個(gè)月 、4個(gè)月 )額葉、頂葉、海馬及皮質(zhì)下區(qū)局部腦血流量(rCBF)[1]。

1.4 免疫組化檢測(cè)癡呆大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)中 IL-1β、IL-6及 TNF-α的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(SP法),其步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟經(jīng)乙醇脫水;(2)PBS沖洗 5min×3;(3)3%H2O2-蒸餾水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 25min;(4)PBS沖洗 5min×3;(5)將切片置入盛有抗原修復(fù)液的容器中,抗原修復(fù)液為 0.01mol pH=6.0的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液),置爐上加熱至溫度達(dá)到 92℃～98℃之間,保持5min關(guān)火,5min后從爐上移下,待溫度冷卻至70℃,入 PBS沖洗 5min×3;(6)加山羊血清(1∶20)封閉30min;(7)傾去多余的血清,滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于切片上,4℃冰箱過(guò)夜;(8)PBS沖洗 5min×3;(9)滴加二抗(IgG/Biotin),孵育 40min;(10)PBS沖洗 5min×3;(11)滴加三抗(S-A/HRP)孵育40min;(12)PBS沖洗 5min×3;(13)DAB-蒸餾水溶液顯色,顯微鏡下觀察,控制反應(yīng)時(shí)間;(14)Mayer蘇木精復(fù)染,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定:免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色或棕黑色顆粒。對(duì)照:用 PBS代替一抗做陰性對(duì)照。定量分析計(jì)數(shù)方法:在顳葉、海馬區(qū)的錐體細(xì)胞層,在 20×10倍光鏡下隨機(jī)選擇 5個(gè)視野,做免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格,以“個(gè) /視野”為單位,結(jié)果取 5個(gè)視野的平均值。

2 結(jié) 果

2.1 癡呆大鼠海馬及顳葉 IL-1β的變化 IL-1β免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。對(duì)照組有少許的 IL-1β免疫陽(yáng)性細(xì)胞,大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后 24h海馬 IL-1β免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即明顯增高并達(dá)高峰,顳葉在 1w時(shí)達(dá)高峰,以后均逐漸下降,至 4個(gè)月時(shí)仍明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)表1)。

2.2 癡呆大鼠海馬及顳葉 IL-6的變化 IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。對(duì)照組有少許的 IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞,大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后 24h海馬及顳葉IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即明顯增高,并均于 1w時(shí)達(dá)高峰,以后逐漸下降,至 4個(gè)月時(shí)仍明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)表2)。

表1 癡呆大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì) IL-1β免疫陽(yáng)性細(xì)胞的比較

表2 癡呆大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì) IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞的比較

表3 癡呆大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì) TNF-α免疫陽(yáng)性細(xì)胞的比較

2.3 癡呆大鼠海馬及顳葉 TNF-α的變化TNF-α免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。對(duì)照組有少許的 TNF-α免疫陽(yáng)性細(xì)胞,大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后24h海馬及顳葉TNF-α免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即明顯增高,并均于 1w時(shí)達(dá)高峰,以后逐漸下降,至 4個(gè)月時(shí)仍明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)表3)。

3 討 論

認(rèn)知功能障礙是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說(shuō)。與記憶有關(guān)的腦內(nèi)結(jié)構(gòu)主要是大腦皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)、海馬及其鄰近結(jié)構(gòu)、丘腦等。遠(yuǎn)事記憶貯存部位主要在大腦皮層特別是額葉、顳葉;近事記憶在邊緣系統(tǒng),其中海馬是近事記憶信息轉(zhuǎn)變、貯存的主要部位。前期工作中,我們選擇顳葉、海馬作為觀察點(diǎn),發(fā)現(xiàn)顳葉皮質(zhì)錐體細(xì)胞從術(shù)后 24h出現(xiàn)水腫、缺血,以后逐漸發(fā)展成凝固性壞死、變性,錐體細(xì)胞慢性進(jìn)行性脫失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生;海馬區(qū)錐體細(xì)胞也從最初的水腫、缺血逐步發(fā)展成嚴(yán)重脫失、基質(zhì)疏松、微空泡形成,各實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)明顯梗死灶[5]。Sontag等曾報(bào)道,將大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎 60min后處死,并無(wú)明顯的梗死灶[6],這與我們的研究結(jié)果相似。雖然各實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)明顯梗死灶,而大鼠的認(rèn)知功能障礙卻持續(xù)存在[1],我們認(rèn)為這與顳葉皮質(zhì)及海馬區(qū)的神經(jīng)元慢性進(jìn)行性變性、脫失有關(guān)。

以往認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是受血腦屏障保護(hù)的“免疫特免器官”,腦組織僅有很低的免疫活性[7],然而近 10年來(lái)不斷涌現(xiàn)的免疫組織化學(xué)與分子生物學(xué)證據(jù)表明,腦具有一個(gè)活躍的內(nèi)源性免疫系統(tǒng),腦內(nèi)的慢性炎癥可能在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)行性神經(jīng)元死亡過(guò)程中起重要作用[8]。長(zhǎng)期以來(lái),免疫炎癥反應(yīng)作為腦缺血損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的一環(huán)一直倍受人們的關(guān)注。其中,IL-1β、IL-6及TNF-α被視為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血相關(guān)的最主要炎癥反應(yīng)分子。至今,人們對(duì) IL-1β、IL-6及 TNF-α在缺血方面的研究多集中在急性腦缺血尤其是短暫腦缺血后再灌注方面[2～4],而在慢性腦缺血方面研究甚少,有關(guān)慢性腦缺血致血管性癡呆大鼠 IL-1β、IL-6及 TNF-α經(jīng)時(shí)變化的基礎(chǔ)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步探討慢性缺血致血管性癡呆的炎癥機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法制備慢性前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癡呆大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì) IL-1β、IL-6及 TNF-α的經(jīng)時(shí)變化情況,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠的海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)僅有 IL-1β、IL-6及 TNF-α的少量表達(dá),而大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)IL-1β、IL-6及 TNF-α免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高,其免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。其中,IL-1β在海馬于術(shù)后 24h呈現(xiàn)表達(dá)高峰,在顳葉則于 1w時(shí)達(dá)高峰,以后均有所下降,直至4月其表達(dá)仍明顯高于對(duì)照組。而 IL-6及 TNF-α在海馬及顳葉均于 1w時(shí)呈現(xiàn)表達(dá)高峰,以后逐漸下降,至 4個(gè)月時(shí)表達(dá)仍明顯高于對(duì)照組。我們推測(cè)細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6及 TNF-α在慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的持續(xù)高表達(dá),可能是由于大鼠腦血流量的持續(xù)下降引起。腦組織新陳代謝率很高,腦重量只占體重的 2.2%,腦血流量卻占心輸出量的 15%[6]。當(dāng)腦灌注壓開(kāi)始降低時(shí),正常組織通過(guò)擴(kuò)張血管,動(dòng)用循環(huán)儲(chǔ)備來(lái)維持 rCBF不變,當(dāng) rCBF進(jìn)一步下降,因能量供應(yīng)不足,出現(xiàn)細(xì)胞膜電位不穩(wěn),Na+-K+泵障礙,細(xì)胞膜功能受損。Kanno等研究認(rèn)為,腦缺血的功能閾值為正常腦血流量的 50%,當(dāng)腦血流量低于正常的 30%時(shí),將出現(xiàn)梗死灶[9]。本組實(shí)驗(yàn)大鼠腦血流量下降程度未達(dá)到引起梗死的閾值,所以梗死灶出現(xiàn)較少,而這種腦血流的降低作為一種較弱的刺激,雖不足以引起神經(jīng)細(xì)胞壞死,但可能會(huì)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分泌 IL-1β、IL-6及 TNF-α,并通過(guò)一系列免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)腦缺血損傷。結(jié)合腦血流量變化、病理學(xué)及行為學(xué)改變我們推測(cè) IL-1β、IL-6及 TNF-α的慢性持續(xù)性高表達(dá)在慢性腦缺血致血管性癡呆的病理?yè)p傷過(guò)程中起重要作用。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),應(yīng)用免疫抑制劑 FK506可以阻止大鼠慢性腦缺血所致的白質(zhì)疏松及神經(jīng)元損傷[10]。由此提示我們?cè)谥委熉阅X缺血致血管性癡呆的過(guò)程中,輔助抗炎治療可能會(huì)阻斷炎性因子所致的炎癥級(jí)聯(lián)損傷,從而延緩血管性癡呆的病情進(jìn)展。

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