結(jié)腸癌CA-Ⅱ的表達(dá)及其臨床意義

王貴紅，鄭蘭東

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，河南開封 475001）

結(jié)腸癌CA-Ⅱ的表達(dá)及其臨床意義

王貴紅，鄭蘭東

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，河南開封 475001）

目的：探討結(jié)腸癌中碳酸酐酶-Ⅱ（CA-Ⅱ）的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和生物學(xué)行為的關(guān)系。方法：采用免疫組化SP法測定40例結(jié)腸癌中CA-Ⅱ基因?qū)氲浇Y(jié)腸癌細(xì)胞中，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。結(jié)果：CA-Ⅱ在癌旁正常組織中表達(dá)陽性率為100%，在結(jié)腸癌組織中表達(dá)陽性率為30%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)腸癌組織中CA-Ⅱ的表達(dá)與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05）；與組織分型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。將CA-ⅡcDNA克隆轉(zhuǎn)染HR-8384細(xì)胞后，癌細(xì)胞侵襲、趨化運(yùn)動能力及耐受性均明顯減弱。結(jié)論：CA-Ⅱ在結(jié)腸癌中的表達(dá)影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和生物學(xué)行為。

結(jié)腸癌；碳酸酐酶－Ⅱ；腫瘤

碳酸酐酶Ⅱ（CA-Ⅱ）是含鋅金屬酶－碳酸酐酶家族中的一員，因其分布廣泛、較高的催化效率和重要的生理學(xué)作用，目前已成研究的熱點(diǎn)。但關(guān)于CA-Ⅱ與結(jié)腸癌之間關(guān)系的研究甚少。本研究采用免疫組化SP法，觀察結(jié)腸癌和癌旁正常組織中CA-Ⅱ的表達(dá)情況，以及CA-Ⅱ與臨床病理因素之間的關(guān)系，同時研究CA-Ⅱ?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，從而為篩選臨床腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本院2009年8月～2010年3月手術(shù)切除結(jié)腸癌標(biāo)本40例，其中，男22例，女 18例；年齡 45～82（平均 62）歲。 術(shù)后病理報(bào)告：乳頭狀腺癌23例，管狀腺癌11例，黏液癌4例，未分化癌2例。高、中分化癌16例，低、未分化癌24例。淋巴轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。術(shù)前均未作放、化療。癌旁正常組織作為對照。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組化SP法，DAB染色。CA-Ⅱ多克隆抗體（兔抗人）購自Santa Cruz公司。SP試劑盒購自美國Zymed公司。工作濃度為1∶100。用已知的結(jié)腸癌CA-Ⅱ陽性切片作陽性對照，用PBC代替－抗作陰性對照。按照SP試劑盒所附的說明書進(jìn)行操作。

1.3 免疫組化結(jié)果的判斷

CA-Ⅱ陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜染成棕黃色或棕褐色，取染色明顯的部位，高倍鏡下取4個不同視野連續(xù)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞。判斷如下：陽性細(xì)胞數(shù)＜25%或無顯色為（－），25%～50%（＋），＞50%（++）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）方法從正常結(jié)構(gòu)黏膜組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中克隆CA-ⅡcDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體PCDNA3.1－CA-Ⅱ。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PCDNA3.1－CA-Ⅱ轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HR－8384細(xì)胞。

1.5 觀察結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變

1.5.1 腫瘤細(xì)胞的侵襲能力 細(xì)胞侵襲基底膜實(shí)驗(yàn)在Transwell小室（Costar公司）中進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)視野中的細(xì)胞數(shù)目，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.5.2 腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動能力 在聚脂酸濾膜（8 μm孔徑）上下表面分別覆蓋5 μm纖粘連蛋白（promege公司），黏附于Transwell小室。細(xì)胞株經(jīng)EDTA/PBS消化后約2.5×105個細(xì)胞進(jìn)入到Transwell小室中，統(tǒng)計(jì)視野中的細(xì)胞數(shù)目，以細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動能力。

1.6 四唑鹽比色試驗(yàn)（MTT）

以轉(zhuǎn)染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組；以未轉(zhuǎn)染PCDNA3.1－CA-Ⅱ的細(xì)胞為對照組。分別觀察氟尿嘧啶及奧沙利鉑藥物對其的抑制率。抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對照組的光度值）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA-Ⅱ在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

CA-Ⅱ在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率為30%，陰性率為70%。癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為100%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 CA-Ⅱ在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)（n）

2.2 結(jié)腸癌組織CA-Ⅱ的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中CA-Ⅱ的表達(dá)陰性率與年齡、性別無關(guān)（P＞0.05），與組織分型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），見表 2。

表2 結(jié)腸癌組織CA-Ⅱ的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系（n）

2.3 轉(zhuǎn)染CA-Ⅱ癌細(xì)胞的侵襲和趨化運(yùn)動能力

轉(zhuǎn)染CA-Ⅱ癌細(xì)胞的侵襲能力、趨化運(yùn)動能力較未轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞明顯下降（P＜0.05），MTT實(shí)驗(yàn)顯示氟尿嘧啶和奧沙利鉑對轉(zhuǎn)染CA-Ⅱ的癌細(xì)胞的抑制率較未轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。

3 討論

CA-Ⅱ是一個28KD的胞漿內(nèi)酶，分布廣泛，幾乎在所有組織或器官的細(xì)胞漿內(nèi)均有表達(dá)[1]。在結(jié)腸組織中，它定位于結(jié)腸的內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，促進(jìn)遠(yuǎn)端結(jié)腸上皮分泌——H+和HCO3-，有利于機(jī)體水、電解質(zhì)及酸堿平衡。同時，CA-Ⅱ可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞功能紊亂，甚至腫瘤細(xì)胞的死亡[2]。若缺乏CA-Ⅱ，腫瘤組織中pH值下降，氧分壓降低，腫瘤細(xì)胞代謝障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞呈失控性生長[3]。因此，CA-Ⅱ通過改變腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，如pH值下降、水電解質(zhì)及酸堿平衡失調(diào)或低氧分壓等，影響代謝過程（如糖原合成，脂肪酸和氨基酸的合成等），從而成為抗腫瘤因子—抑瘤基因[4]。同時研究發(fā)現(xiàn)大腸癌組織CA陽性組的預(yù)后明顯好于陰性組[5-6]。因此有學(xué)者提出CA-Ⅱ可作為一種腫瘤標(biāo)志物[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)CA-Ⅱ在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率為30%，陰性率為70%，而癌旁正常組織中的表達(dá)陽性率為100%，說明CA-Ⅱ在結(jié)腸癌級織中的表達(dá)下降。同時，還發(fā)現(xiàn)CA-Ⅱ的表達(dá)陰性率與組織學(xué)分型、分化程度和淋結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步證明CA-Ⅱ可能為一種高癌基因，筆者采用轉(zhuǎn)染方法，將轉(zhuǎn)染CA-Ⅱ基因的結(jié)腸癌細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、細(xì)胞趨化運(yùn)動能力以及對抗癌藥物的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)二者有明顯差異。

這進(jìn)一步證明CA-Ⅱ的表達(dá)與結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和生物學(xué)行為密切相關(guān)，CA-Ⅱ在抑制結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這與碳酸酐酶既可作為篩選結(jié)腸癌的有用指標(biāo)，又與碳酸酐酶可用于防治結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究相一致[8]。有關(guān)CA-Ⅱ作為結(jié)腸癌的抑癌基因更明確的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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The expression of CA-Ⅱin colonic cancer and its clinical significance

WANG Guihong,ZHENG Landong
(Department of General Surgery,First Affiliated Hospital of Henan University,Henan Province,Kaifeng 475001,China)

Objective:To evaluate the expression of carbonic anbydraseⅡ (CA-Ⅱ)in colonic carcer associated with invasion,metastasis and biological behavior.Methods:The immunohisto-chemistry was used to detect the expression of CA-ⅡcDNA,and the changes of cell biological behavior was observed.Results:The positive rate of CA-Ⅱin side tissue of colonic cancer was 100%and in colonic cancer was 30%,the contrastive difference was visible(P＜0.05).The expression of CA-Ⅱ in colonic carcer was not related to age and sex(P＞0.05),and related to tissue type,different grade and lymph node metstasis(P<0.05).After transfection with human cDNA,the love cells changed obviously with reduction in invasion,chemotary motor ability and tolerance.Conclusion:The expression of CA-Ⅱin colonic cancer affect the invasion,metastasis and biological behavior.

Colonic cancer;Carbonic anhydvaseⅡ;Cancer

R574.62

A

1674-4721（2010）09（a）-005-02

王貴紅（1971-），男，主治醫(yī)師，在職研究生學(xué)歷（鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院2001級），從事普通外科腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。鄭蘭東，男，主任醫(yī)師；研究方向：普通外科腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

2010-07-12）