犬外周血基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其橫向分化潛能研究

韓 雪 劉洪臣 王東勝 蘇 方 孫 斌 吳 霞

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為成體干細(xì)胞領(lǐng)域研究較多的一類干細(xì)胞，在細(xì)胞治療、基因治療及組織工程領(lǐng)域具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。但骨髓的抽取過(guò)程患者不易接受，而且數(shù)量極少，1×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中僅有1個(gè)BMSC[1]，且隨著年齡的增加或體質(zhì)的衰弱，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，使獲取大量的BMSCs受到限制。外周血來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(peripheral blood stromal cells，PBSCs)與BMSCs有很多相似的特性，同時(shí)又具有來(lái)源豐富、較易獲取、自體移植時(shí)無(wú)免疫排斥等諸多優(yōu)點(diǎn)，日益突顯出在細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì),具有廣泛的研究?jī)r(jià)值及廣闊的臨床應(yīng)用前景。

目前，雖然對(duì)PBSCs的研究取得了一定的成果，但仍有許多問(wèn)題有待于進(jìn)一步闡明。例如，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)還不全面，如何有效獲取以及其體內(nèi)、體外的分化潛能尚需要更多研究結(jié)果的證實(shí)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以犬為研究對(duì)象，對(duì)PBSCs的分離培養(yǎng)、橫向分化潛能進(jìn)行系統(tǒng)性研究，從而為其作為種子細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性雜種犬1只，身體健康，體重約15kg，解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備 淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司)，α-MEM培養(yǎng)液、FBS、L-谷氨酰胺(美國(guó)Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司)，β-甘油磷酸鈉、胰島素、地塞米松、引哚美辛、IBMX、抗壞血酸(美國(guó)Sigma公司)，小鼠抗人CD34、CD105單克隆抗體(北京中杉金橋公司)，OPN抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，超敏鼠二步法檢測(cè)試劑(北京中杉金橋公司)。

CO2恒溫孵箱(美國(guó)Thermo Forma公司)，超凈工作臺(tái)(北京昌平凈化設(shè)備廠)，倒置相差顯微鏡(德國(guó) Leica 公司)。

1.3 PBSCs的分離與原代培養(yǎng)[2]取成年犬，剪除前肢毛發(fā)，碘伏消毒，肝素化注射器穿刺入靜脈抽血，約15-20mL。用等量培養(yǎng)基稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液表面，離心20min。收集中間云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞帶，α-MEM完全培養(yǎng)液重懸，清洗3次。以5×106/mL密度接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3天進(jìn)行換液。

1.4 傳代培養(yǎng) PBSCs原代培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)近融合后，傾倒培養(yǎng)液，PBS液漂洗兩次，加入0.25%的胰蛋白酶浸潤(rùn)瓶底細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。消化約1min后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，終止消化，按1∶2比例進(jìn)行接種，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況以及形態(tài)變化。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取P4代PBSCs細(xì)胞消化，接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)4天后，4%多聚甲醛固定20min，PBS代替一抗為空白對(duì)照，免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法行CD34和CD105染色。

1.6 犬PBSCs的橫向分化

1.6.1 成骨誘導(dǎo)

取P4代PBSCs細(xì)胞消化，接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔板內(nèi)，用普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。待細(xì)胞長(zhǎng)到50%融合后，實(shí)驗(yàn)組更換為成骨誘導(dǎo)液（10-8mol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸），對(duì)照組繼續(xù)用普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)14天后，95%乙醇固定，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察OPN表達(dá)情況；培養(yǎng)28天，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.6.2 成脂誘導(dǎo)

取P4代PBSCs細(xì)胞消化，接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔板內(nèi)，用普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。待細(xì)胞長(zhǎng)到50%融合后，實(shí)驗(yàn)組更換為成脂誘導(dǎo)液(1μmol/L地塞米松，10 mg/L胰島素，0.2 mmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX)培養(yǎng)，對(duì)照組繼續(xù)用普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)變化及胞內(nèi)脂滴形成情況。每 2-3天對(duì)細(xì)胞換液，10-14天后根據(jù)分化的情況用10%福爾馬林固定進(jìn)行油紅O染色。

2.結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察 原代培養(yǎng)前 3天細(xì)胞多處于懸浮狀態(tài)，貼壁細(xì)胞少，形態(tài)以圓形或橢圓形為主。之后開(kāi)始出現(xiàn)部分貼壁細(xì)胞，呈短梭形，分布不均。7天后貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞集落開(kāi)始出現(xiàn)，部分細(xì)胞開(kāi)始伸展成長(zhǎng)梭形。13-16天時(shí)細(xì)胞集落擴(kuò)大較明顯，細(xì)胞以梭形及多邊形為主(圖 1-a)。

原代培養(yǎng)成功的PBSCs細(xì)胞按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，48-72小時(shí)后絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁，PBSCs呈紡錘形生長(zhǎng)，形態(tài)較原代時(shí)均一(圖1-b)，生長(zhǎng)速度也較原代有所增快，約3-4天時(shí)再次傳代。此后的P2、P3代的純度變高。

2.2 細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果 外周血基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD105(圖2-a)，不表達(dá)CD34(圖2-b)。

圖1-a 原代PBSCs培養(yǎng)至13天，細(xì)胞集落擴(kuò)大較明顯，細(xì)胞以梭形及多邊形為主(×100)

圖1-b 傳代PBSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)均一，多數(shù)細(xì)胞呈紡錘形(×100)

圖2-a 外周血基質(zhì)細(xì)胞CD105染色陽(yáng)性(×200)

圖2-b 外周血基質(zhì)細(xì)胞CD34染色陰性(×200)

2.3 成骨誘導(dǎo) 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天可見(jiàn)細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，局部增厚，細(xì)胞呈重疊生長(zhǎng)，OPN免疫化學(xué)染色陽(yáng)性(圖3-a)。培養(yǎng)28天茜素紅染色見(jiàn)深紅色斑塊，為鈣鹽特征性染色(圖3-b)。

圖3-a PBSCs成骨誘導(dǎo)14天，OPN染色胞漿可見(jiàn)棕黃色顆粒(×100)

圖3-b PBSCs成骨誘導(dǎo)28天，茜素紅染色(×100)

2.4 成脂誘導(dǎo) PBSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10天左右有少量脂滴出現(xiàn)，14天脂滴量顯著增加，油紅O染色呈陽(yáng)性(圖4)。

3.討論

本研究體外培養(yǎng)犬外周血基質(zhì)細(xì)胞(PBSCs)，檢測(cè)其表面標(biāo)志物及其橫向分化潛能，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。PBSCs較其他來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞有可反復(fù)取材、方便、安全、不需麻醉、對(duì)病人造成痛苦少等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)被廣泛關(guān)注。

圖4 PBSCs成脂誘導(dǎo)2周，油紅O染色陽(yáng)性(×100)

迄今為止，許多研究證實(shí)多種哺乳動(dòng)物包括兔[3,4]、狗[5]、鼠[6]、馬[7,8]和人[6,9]的外周血都存在基質(zhì)細(xì)胞。但也有一些研究沒(méi)有檢測(cè)到PBSCs[10,11]，分析其原因主要是因?yàn)橥庵苎械幕|(zhì)細(xì)胞含量極低，骨髓基質(zhì)細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的總數(shù)的0.001%-0.01%[12]。與BMSCs相比，PBSCs細(xì)胞克隆形成率更低，小鼠約1/106單個(gè)核細(xì)胞，兔約1/107單個(gè)核細(xì)胞，而人僅1/108單個(gè)核細(xì)胞[6]，另外也與研究中所采用的原代培養(yǎng)方法(包括分離方法和培養(yǎng)基)、動(dòng)物模型(包括種屬、年齡、體重以及預(yù)先進(jìn)行動(dòng)員情況)的選取有關(guān)。

由于基質(zhì)細(xì)胞具有在塑料培養(yǎng)板上貼壁生長(zhǎng)的特性，本實(shí)驗(yàn)采用淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心法并結(jié)合貼壁分離篩選法來(lái)分離純化外周血基質(zhì)細(xì)胞，將兩者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，有效的避免了一些缺陷。所獲取的PBSCs在原代培養(yǎng)的5天左右開(kāi)始出現(xiàn)部分貼壁細(xì)胞，呈短梭形。7天后貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞集落開(kāi)始出現(xiàn)，部分細(xì)胞開(kāi)始伸展呈長(zhǎng)梭形。13-16天時(shí)細(xì)胞集落擴(kuò)大明顯，細(xì)胞以梭形及多邊形為主(圖1-a)?？梢?jiàn)PBSCs的細(xì)胞貼壁較晚，分離效率較骨髓明顯低下，這也是制約PBSCs臨床應(yīng)用的主要原因。

目前對(duì)于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物尚無(wú)確定結(jié)論，大部分關(guān)于表型特征的描述是通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法來(lái)獲得的。利用流式細(xì)胞儀的研究顯示，體外擴(kuò)增的基質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物具有非特異性，表達(dá)CD105,CD73,CD90,CD166,CD44和CD29[11]。而體外擴(kuò)增的骨髓基質(zhì)細(xì)胞則不表達(dá)造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系的標(biāo)志物CD14、CD31、CD34和CD45。與骨髓相同，外周血來(lái)源的單個(gè)核系統(tǒng)中也包含間質(zhì)系與造血系兩大系統(tǒng)，其多向分化能力來(lái)源于間質(zhì)系統(tǒng)的基質(zhì)細(xì)胞，可在定向誘導(dǎo)條件下多向分化。PBSCs與BMSCs在表征上有許多共同點(diǎn)，Zvaifler等[2]從正常成年人外周血中成功分離出貼壁生長(zhǎng)的外周血基質(zhì)細(xì)胞，它們同樣不表達(dá) CD45、CD14和 CD34，表達(dá) CD105、vimentin、collagen I、BMP-RIA 和 BMP-RII。本實(shí)驗(yàn)利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)CD34和CD105，結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD105，不表達(dá)CD34，證明該細(xì)胞屬間質(zhì)系，同時(shí)隨著細(xì)胞的傳代，細(xì)胞進(jìn)一步得以純化。

本文之所以使用“基質(zhì)細(xì)胞(stromal cells)”，而沒(méi)有使用“間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)”，是由于并沒(méi)有進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞克隆基礎(chǔ)上的嚴(yán)格鑒定。而間充質(zhì)干細(xì)胞是一個(gè)嚴(yán)格的概念，需要對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)期的自我更新能力和發(fā)育潛能進(jìn)行嚴(yán)格鑒定。國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)給出了多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的定義[13]：經(jīng)過(guò)一定技術(shù)手段純化和富集的含有間充質(zhì)干細(xì)胞的混合貼壁細(xì)胞。并提出了多潛能間質(zhì)細(xì)胞鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)[14]：(1)多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞一定是標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的貼壁細(xì)胞；(2)表達(dá) CD105、CD73和 CD90，低表達(dá)或不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR；(3)在體外標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)條件下可分化成至少三種不同類型的細(xì)胞：成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。如果沒(méi)有按照上述標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格鑒定，應(yīng)稱為“基質(zhì)細(xì)胞”[14]。因此本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為“外周血基質(zhì)細(xì)胞”。

茜素紅染色常被用來(lái)鑒定細(xì)胞的成骨能力，其原理是茜素紅染料可以與鈣離子結(jié)合形成深紅色的螯合物；OPN是重要的礦化組織非膠原基質(zhì)蛋白，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，在成骨細(xì)胞分化早期開(kāi)始表達(dá)，礦化啟動(dòng)后大量合成。油紅O染色的原理是使用油紅O的油溶性，對(duì)其它的細(xì)胞結(jié)構(gòu)著色性差。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的PBSCs在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)后使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉積下來(lái)，即鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽(yáng)性；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)骨橋蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，骨橋蛋白明顯表達(dá)。經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞漿中有油滴形成，油紅O染色陽(yáng)性。證明PBSCs具有向成骨、成脂方向分化的能力。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)從外周血中可分離培養(yǎng)出基質(zhì)細(xì)胞，它們具有與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相似的特性與分化能力，能向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化，有望成為細(xì)胞治療或組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源。

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