重金屬脅迫對2種地被竹抗氧化酶與脂質(zhì)過氧化的影響

王兵 曹幫華 蔡春菊

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安 271014)

重金屬脅迫對2種地被竹抗氧化酶與脂質(zhì)過氧化的影響

王兵 曹幫華 蔡春菊

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安 271014)

采用盆栽法對4種重金屬(Cd2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+)脅迫下的菲黃竹與菲白竹葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菲黃竹的SOD、POD、及CAT活性隨著重金屬濃度的增加總體趨勢是先增大，之后降低，最后又增大；而菲白竹則是先升高，后降低；過氧化產(chǎn)物(MDA)則于酶活性的變化趨勢相反。表明重金屬脅迫下，2種地被竹體內(nèi)的抗氧化酶活性被誘導(dǎo)，且菲白竹比菲黃竹有更強的耐重金屬脅迫性。

重金屬脅迫；抗氧化酶；地被竹

竹為禾本科竹亞科植物，在中國分布有400多種，是我國主要的經(jīng)濟(jì)植物，素有第二森林之稱[1]。竹子在園林綠化中的應(yīng)用愈來愈廣，尤其觀賞竹的發(fā)展已經(jīng)頗受重視，但是日益復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境常常限制了竹類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其在重金屬的源地，大多植物都不能生存，為了篩選出對重金屬具有一定抗性的地被竹種，特以菲黃竹和菲白竹做試驗材料，進(jìn)行抗性生理研究。

重金屬對植物的生長發(fā)育危害極大,可以通過植物的各種生理指標(biāo)得到反映。進(jìn)入植物體的重金屬通常會改變細(xì)胞膜透性,也可使葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,以致葉綠素含量下降, 破環(huán)光合系統(tǒng)的完整性,打破細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡,另外,還會影響植物的呼吸作用[2],從而引起植物一系列生理代謝紊亂[3]。在正常環(huán)境下，氧自由基的濃度維持低水平是由于抗氧化酶的活性能夠處于平衡狀態(tài)。在脅迫條件下，氧自由基增加，誘發(fā)了植物體內(nèi)抗氧化酶的活性[4]。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的毒性產(chǎn)物，也是一種植物組織遭受自由基持續(xù)破壞的一個重要指標(biāo)(Ohkawa，1979)。因此，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性已經(jīng)廣泛用于研究脅迫對植物的影響。對于地被竹植物的抗性研究，以往主要集中于對低溫、水分虧損、耐蔭性等方面，對于它們在重金屬條件下的生理及生化機(jī)制研究則未見報道。

1 材料和方法。

1.1 材料

于2009年6月，從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗站的大田中選擇長勢良好的菲黃竹和菲白竹定植到規(guī)格為28cmx19cm的塑料花盆中，裝入盆土10kg左右，擺放到大田中，進(jìn)行正常的田間管理。于8月中旬苗木生長穩(wěn)定后，選擇長勢均勻的盆栽竹苗移入防雨棚中，在每個花盆下面墊一個托盤，連續(xù)在土壤飽和水分條件下平衡幾天，使盆栽材料達(dá)到穩(wěn)定生長狀態(tài)。采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，單盆小區(qū)，6次重復(fù)，以濃度梯度進(jìn)行地被竹的抗重金屬的測定。

1.2 金屬處理方法

根據(jù)國家鉛鎘污染標(biāo)準(zhǔn)，將鉛(Pb)、鎘Cd) 與銅(Cu)鋅(Zn)重金屬按不同的濃度混合，分為4個處理的復(fù)合污染，其中Cd以CdCl2?2.5H2O鹽溶液的形式加入，Pb以Pb(NO3)2鹽溶液的形式加入，Cu以CuCl2?2H2O鹽溶液的形式加入，Zn以ZnS04?7H2O的形式加入。以不加重金屬溶液為對照設(shè)為L0，其他水平因素如下表所示。在15 d、30 d和45 d時，分別取樣測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性及MDA的含量。

1.3 酶液的提取

(1)酶的提取: 取0.5 g新鮮的葉片洗凈后，加入5 mL 50 mmol/L PBS(pH 7. 8，含1.0 mmol/L EDTA和2% PVP)。 于冰浴中研磨至勻漿，并在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，所得上清液即可用于酶活性測定。

(2)酶活性測定方法:SOD活性測定參照李美茹等[5]的方法;POD及CAT活性測定參照波欽諾克[6]的方法;MDA含量的測定參照孟慶偉[7]的方法。

表1 不同處理下的重金屬離子濃度Table1 The heavy metal ion concentration under different treatment（mg/kg）

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性是反映植物抗逆性強弱的重要指標(biāo)之一[8]。它能夠消除O2，降低膜的過氧化，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[9]。不同濃度的復(fù)合重金屬處理下，2種地被竹的SOD活性變化如圖1所示。

由圖1可以看出，菲白竹與菲黃竹在重金屬脅迫下，隨著復(fù)合重金屬濃度的不斷增大，SOD活性總的變化趨勢是相似的，即先增大后再降低。對于菲黃竹來說，其SOD活性在L1水平時出現(xiàn)最高值，在L3水平時出現(xiàn)最低值，對于菲白竹來說，其SOD活性在L2水平時出現(xiàn)最高值，在L3水平時出現(xiàn)最低值，而對于2種地被竹，L1水平和L2水平處理其SOD活性均高于對照，而L3水平和L4水平均低于對照。且3次不同時間的測定表明，在一定的時間范圍內(nèi)，這種變化趨勢是大體一致的，但是隨著時間的推移，不同處理水平下的SOD活性都有不同程度的降低。通過2種地被竹比較可以看出，45d時在L3水平和L4水平上，其SOD的活性開始超過15d和30d的活性時,說明了重金屬脅迫下的2種竹子的SOD酶已經(jīng)趨于穩(wěn)定。

2.2 POD活性

POD可以催化活性氧H2O2，H2O2是氧化過程中一個主要的毒性中間體，因此POD在抗氧化過程中起到重要的作用，且POD活性的變化是監(jiān)測植物受重金屬毒害的重要指標(biāo)之一[10]。2種地被竹在復(fù)合重金屬脅迫下POD的活性變化如圖2所示。在3個處理時間內(nèi)，菲黃竹與菲白竹POD活性的總的變化趨勢是隨復(fù)合重金屬濃度的升高，先一定程度的上升，后降低，后又上升。對于菲黃竹來說，其POD活性的最高值出現(xiàn)在L1水平，最低值出現(xiàn)在L3水平。除在LI水平，其POD活性高于對照外，其余水平都低于對照，對于菲白竹來說，其POD活性的最高值出現(xiàn)在L2水平，最低值也出現(xiàn)在L3水平，但是其活性除15d時的L3水平低于對照外，其余的都高于對照，以15d時的L2水平為最高，其活性為對照組活性的141.9%。 2種地被竹POD活性相比，菲黃竹的POD活性總體上高于菲白竹，但是在重金屬脅迫下，菲黃竹POD活性卻表現(xiàn)出整體下降的趨勢，說明菲黃竹在重金屬脅迫環(huán)境下的抗性是低于菲白竹的。

2.3 CAT活性

CAT是清除H2O2的另一種關(guān)鍵酶，CAT主要存在于過氧化體中，負(fù)責(zé)過氧化體中產(chǎn)生的H2O2的清除，并與POD起協(xié)同作用，清除植物體內(nèi)過多的氧自由基[11,12]。重金屬脅迫下，菲黃竹與菲白竹的CAT活性變化見圖3?？梢钥闯?，菲黃竹CAT活性隨重金屬濃度的增大，保持先升高，后降低，再上升的趨勢。在L1水平達(dá)到最大值, 以30d時的L1水平為最高，為對照組的126.05%。在L3達(dá)到最低值。除在L1水平其活性高于對照外，其它的處理水平均低于對照。而菲白竹的CAT活性隨重金屬濃度的增大，先升高，后下降。在15d和45d時，在L2水平達(dá)到最大值，30d時，在L1水平達(dá)最大，以45d的L2水平活性最高,且為對照組的133.6%，但3次測定均在L3水平時達(dá)最低值。通過比較可以看出, 菲白竹在重金屬脅迫下, 其CAT活性相對菲黃竹較穩(wěn)定, 有更強的耐重金屬能力.

2.4 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物

脂質(zhì)過氧化通常以MDA的含量來衡量[13]。菲黃竹與菲白竹的MDA含量如圖4所示?？梢缘贸觯泣S竹的MDA含量呈現(xiàn)出總體上升的趨勢，以L3水平的為最高，分別為對照的96.5%，114.8%，108.6%，在L4水平時有一定程度的降低。而菲白竹的MDA含量則表現(xiàn)出整體下降的趨勢，但是下降幅度較小，以15d時L2水平為最小值，為對照的79.17%。且處理組的MDA含量均低于對照, 說明菲白竹的抗氧化酶系統(tǒng)起到了穩(wěn)定清除自由基的作用。從圖4還可以看出，菲黃竹的總的MDA的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菲白竹，這說明在重金屬脅迫的過程中，菲黃竹產(chǎn)生的凈過氧化產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于菲白竹，對其膜系統(tǒng)的傷害程度更大。說明菲白竹比菲黃竹在重金屬逆境下有更強的抗氧化能力，即菲白竹的抗逆性更強。

3 結(jié)論與討論

(1)正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧代謝保持平衡。當(dāng)重金屬處理植物時，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡受到破壞，導(dǎo)致大量的O2、OH、NO、HOO、RO、ROO、O2、H2O2、ROOH等活性氧自由基產(chǎn)生，從而使蛋白質(zhì)和生物大分子變性、細(xì)胞膜脂過氧化加劇，傷害植物[14]。目前認(rèn)為活性氧水平升高導(dǎo)致的膜脂過氧化加劇是膜損傷的重要原因[15-17]。SOD、POD及CAT作為植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，能夠有效的清除脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧，使植物體內(nèi)的活性氧維持在一個低水平上。SOD是清除自由基的最關(guān)鍵酶類之一[18]，它能催化分子氧活化的第一個中間產(chǎn)物O2發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，而H2O2的清除則需要POD或者CAT2種關(guān)鍵酶，三者互相協(xié)調(diào)， 從而減小自由基對膜的傷害程度，但是隨著自由基水平的升高，保護(hù)酶系統(tǒng)不能及時的清除較多的自由基時，就會積累有害的過氧化產(chǎn)物，如丙二醛等，植物細(xì)胞受到一定程度的傷害[19]。

(2)當(dāng)菲黃竹和菲白竹受到重金屬脅迫時，2種地被竹的SOD、POD及CAT活性均有不同程度的升高，說明外界的復(fù)合重金屬對這些抗氧化酶活性具有一定的誘導(dǎo)能力，隨重金屬濃度的不斷增大，SOD、POD及CAT活性整體都表現(xiàn)出升高的趨勢，菲黃竹的SOD、POD及CAT活性L1水平時出現(xiàn)最高值，L3水平時出現(xiàn)最低值，菲白竹的SOD、POD及CAT活性在L2水平時出現(xiàn)最高值，也在L3水平時出現(xiàn)最低值。說明這些抗氧化酶的活性表現(xiàn)是大體一致的。而MDA含量則表現(xiàn)出相反的趨勢，在L3水平時出現(xiàn)最大值，與酶活性表現(xiàn)出了一定的負(fù)相關(guān)性。在輕度的脅迫下，即重金屬濃度在L1水平L2水平時，3種抗氧化酶的活性比對照都有不同程度的上升，但是，菲白竹的上升程度明顯高于菲黃竹，但在高濃度即L3水平時，其活性降低，酶活性的下降導(dǎo)致了植株體內(nèi)自由基的代謝平衡被打破，造成了過氧化產(chǎn)物MDA含量的增加。但是在L4水平時，雖然重金屬濃度最大，但是各種酶活性卻有一定的上升，這可能是由于高濃度的重金屬之間的一種拮抗作用，導(dǎo)致重金屬對植株的脅迫能力有所下降。

總之，在外界重金屬的脅迫下，2種地被竹的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)保護(hù)系統(tǒng)活性均被誘導(dǎo)，以消除積累的活性氧對膜系統(tǒng)的破壞，但是隨著金屬濃度的不斷增大，抗氧化酶活性受到一定程度的影響，可能干擾了這些酶的合成，破壞了酶蛋白的結(jié)構(gòu)，使活性氧自由基數(shù)量超過了植株本身的清除能力，最終這些酶的活性下降，導(dǎo)致兩種地被竹的生長受到抑制[20]。兩種地被竹通過抗氧化機(jī)制來抵御不同的重金屬脅迫，從而保證植株受到不良外界的最小的傷害。

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Effect of Heavy Metal Stress on Antioxidative Enzymes and Lipid Peroxidation in Two Dwarf Bamboos(Sasa auricomaandArundinaria fortunei)

Wang Bing, Cao Banghua, Cai Chunju
(Agricultral University of Shandong, Taian 271014)

Superoxide dismutase (SOD) , peroxidase (POD) , catalase (CAT) and product of lipid peroxidation(MDA) in leaves of two dwarf bamboos,Sasa auricomaandArundinaria fortuneiunder multiple heavy metal stress (Cd, Pb, Cu and Zn) were studied through potting culture method. The results showed that in leaves of heavy- metal-stressed plants the activities of SOD, POD and CAT ascended at first, then declined and ascended at last with stress levels increasing inSasa auricoma, reaching its maximum at L1. In comparison with the control, the activities of SOD, CAT, and POD ofArundinaria fortuneiin heavy- metalstressed condition all ascended at fi rst and then declined, reaching its maximum is at L2, while the peroxidation products (MDA) represented the opposite trend in terms of activity. These results indicate that in heavy-metalstress, antioxidative activities may play an important role in the two dwarf bamboos, andArundinaria fortuneiis more tolerant to heavy metals thanSasa auricoma.

heavy-metal-stress, antioxidative enzymes, dwarf bamboo

* 依托項目：十一五支撐計劃，項目編號為1632009009。

王兵 (1986-), 漢族，女，在讀研究生。研究方向為森林培育。