巢氏PCR判定西藏瘧疾流行區(qū)傳瘧媒介*

武 松,黃 芳,張國(guó)慶,潘嘉云,王學(xué)忠,卓瑪央金,胡永紅,湯林華

2.中國(guó)疾病控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所,世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心,上海 200025;

3.云南省寄生蟲病研究所,普洱 665000;

4.西藏自治區(qū)林芝地區(qū)疾病預(yù)防控制中心,林芝860100

巢氏PCR判定西藏瘧疾流行區(qū)傳瘧媒介*

武 松1,黃 芳2,張國(guó)慶2,潘嘉云2,王學(xué)忠3,卓瑪央金4,胡永紅4,湯林華2

目的確定西藏墨脫縣瘧疾流行區(qū)的瘧疾傳播媒介。方法根據(jù)2005、2006和2007年瘧疾發(fā)病情況,在墨脫縣選擇了3個(gè)瘧疾發(fā)病較高的自然村,采用人誘、牛誘、燈誘及清晨人房全捕等方法捕獲成蚊,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后麻醉處死,密封干燥,帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃凍存?zhèn)溆?采用混合樣本法隨機(jī)抽取10只多斑按蚊復(fù)合體為一份混合標(biāo)本,提取蚊蟲DNA。根據(jù)文獻(xiàn)采用巢氏PCR擴(kuò)增瘧原蟲小亞單位核糖體脫氧核糖核酸(SSU rDNA),并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果克隆測(cè)序,比對(duì)證實(shí)。結(jié)果共捕獲按蚊5 345只,其中多斑按蚊復(fù)合體5 190只,帶足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊復(fù)合體混合樣本DNA中發(fā)現(xiàn)子孢子陽(yáng)性擴(kuò)增樣品2份,種型鑒定2份陽(yáng)性混合樣本均為偽威氏按蚊,PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序,NCBI BLAST同源性比對(duì)證實(shí)為瘧原蟲SSu rDNA基因片段。結(jié)論多斑按蚊復(fù)合體中的偽威氏按蚊為西藏林芝瘧疾流行區(qū)的傳瘧媒介。

多斑按蚊復(fù)合體;子孢子;傳瘧媒介;西藏;巢氏聚合酶鏈反應(yīng)

2.中國(guó)疾病控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所,世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心,上海 200025;

3.云南省寄生蟲病研究所,普洱 665000;

4.西藏自治區(qū)林芝地區(qū)疾病預(yù)防控制中心,林芝860100

西藏自治區(qū)于20世紀(jì)50年代就偶有瘧疾報(bào)道,主要分布于東南部雅魯藏布江和察隅河河谷地帶的墨脫和察隅等縣,以及喜馬拉雅山南麓海拔1 500m以下的地區(qū)。林芝地區(qū)是西藏自治區(qū)唯一有瘧疾發(fā)生與流行的地區(qū)〔1〕,其中的墨脫縣地處雅魯藏布江峽谷亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū),自1986—2004年累計(jì)報(bào)告瘧疾病例2 441例,占林芝地區(qū)報(bào)告病例數(shù)的99.3%〔2〕,2005年和2006年瘧疾發(fā)病率分別為568.48/10萬(wàn)和694.08/10萬(wàn),發(fā)病人數(shù)分別占林芝地區(qū)瘧疾總發(fā)病率的 59.14%(59/93)和95.17%(67/70),近年來該地區(qū)的瘧疾發(fā)病呈逐漸增多并存在向周邊蔓延的趨勢(shì),然而該地區(qū)傳瘧媒介至今依舊不清,嚴(yán)重影響著對(duì)該地區(qū)的瘧疾流行形勢(shì)評(píng)價(jià)和瘧疾綜合防制措施的制定,調(diào)查組于2007年7至8月在西藏林芝地區(qū)墨脫縣開展了瘧疾媒介專項(xiàng)調(diào)查,并運(yùn)用PCR的方法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)捕獲的多斑按蚊復(fù)合體進(jìn)行子孢子陽(yáng)性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)與調(diào)查時(shí)間 根據(jù)歷年與當(dāng)年瘧疾發(fā)病情況,在墨脫縣選擇了瘧疾發(fā)病相對(duì)較高的德興鄉(xiāng)德興村(29°33′N,95°30′E),墨脫鎮(zhèn)亞東村(29°32′N,95°33′E)和馬迪村(29°37′N,95°41′E)開展了傳瘧媒介的蚊種調(diào)查。

1.2 成蚊捕獲與形態(tài)鑒定 采用人帳誘捕法、牛餌誘捕法和誘蚊燈誘捕法,在室內(nèi)、室外及人房、牛房捕獲成蚊;同時(shí)采用清晨人牛房全捕、半通宵和全通宵誘捕等方法。對(duì)捕獲的蚊種經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為多斑按蚊復(fù)合體后麻醉處死,每10只裝入打孔的1.5mL離心管,放入裝有干燥劑的自封袋,帶回實(shí)驗(yàn)室后-20℃凍存?zhèn)溆?形態(tài)學(xué)鑒定方法參考陸寶麟〔3〕。

1.3 分子實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 根據(jù)李鳳舞和孫慶文〔4-5〕混合樣本的理論,單只蚊蟲去除腹部、翅膀和腿部,僅留頭胸部,將10只蚊蟲的頭胸部混合作為一個(gè)混合樣本?；旌蠘颖痉湃?.5 mL離心管,加入 150 μ L 65 ℃DEB 溶液和 2.0 μ L RNAse酶(10 μ g/μ L),充分研磨后,放入37℃水浴1h,再加入4.0 μ L 蛋白酶 K(20μ g/μ L),50℃水浴 1h,每管加入苯酚和氯仿各60μ L,充分振蕩混勻,14 000r/min離心10min,取上清于0.5mL離心管中,加入95%冰乙醇300μ L,-20℃沉淀過夜后,14 000r/min離心10min,棄上清,37℃恒溫箱中干燥后,加入 100μ L 1×TE緩沖液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 巢氏PCR擴(kuò)增子孢子 蚊體內(nèi)子孢子檢測(cè)方法采用Snounou〔6〕方案,第一輪 PCR為屬特異擴(kuò)增,引物分別為rPLU5(5'-CCTGTTGTTGCCTTAAACT TC-3')和rPLU6(5'-T TAAAATTGTTGCAGT TAAAACG-3'),第二輪PCR反應(yīng)的引物為針對(duì)SSUrRNA設(shè)計(jì)的種特異性引物,分別為rVIV1(5'-CGCTTCTAGC T TAATCCACATAACTGATAC-3')和rVIV2(5'-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAG A AA GTCCT TA-3')。反應(yīng)體系為 50 μ L,參照 Tassanakajon〔7〕,取首輪反應(yīng)產(chǎn)物1μ L作為第二輪反應(yīng)的模板。兩輪反應(yīng)的條件均為 95℃5min,55℃ 90',72℃ 90',94℃1min,最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃溫育10min。

1.3.3 多斑按蚊復(fù)合體種型鑒定 多斑按蚊復(fù)合體種型鑒定采用馬雅軍〔8〕建立的多重PCR的方法,根據(jù)擴(kuò)增出的ITS2片段的大小就行多斑按蚊種型鑒定。

1.4 試劑與材料 引物、redTaq酶及dNTPs由上海塞百盛公司合成與購(gòu)買,RNA酶和蛋白酶K購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司,PCR儀為BIO-RAD PTC-200型,凝膠成像系統(tǒng)(AlphaImager HP/EP)為美國(guó)Alpha Innotech公司,PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成,CDC誘蚊燈由美國(guó)John W.Hock公司生產(chǎn)(New Standard Miniature Light Traps 512 6V 150mm)。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定本次調(diào)查共捕獲成蚊10 247只,按蚊為5 345只,其中5 190只為多斑按蚊復(fù)合體,占按蚊組成97.10%;帶足按蚊155只,占按蚊組成的2.90%。形態(tài)學(xué)鑒定未能發(fā)現(xiàn)其他種類按蚊。

2.2 子孢子陽(yáng)性檢測(cè) 本次實(shí)驗(yàn)共提取3 600只多斑按蚊復(fù)合體,計(jì)混合樣本360份,其中有兩個(gè)混合樣本擴(kuò)增出121bp的目標(biāo)條帶(見圖1)。對(duì)2個(gè)目標(biāo)條帶進(jìn)行克隆測(cè)序,片段序列為5'-ACT TCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCT TAAAAAGAATCATT TTAAT TAAAAGAACACATAAT AGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACGAAGTATCAGT TATGTGGAT TAAGCTAGAAGCG-3',通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與間日瘧序列AF145335的nt 520～640的序列完全吻合,從而可以判定擴(kuò)增出的確實(shí)為間日瘧的SSUrDNA的基因序列,因此可以判定混合蚊蟲的樣本中含有瘧原蟲。

圖1 巢氏PCR子孢子檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Nested PCR results on sporozoites detection

2.3 種型鑒定 對(duì)檢測(cè)出121bp目標(biāo)片段的2份混合標(biāo)本,進(jìn)行種型鑒定實(shí)驗(yàn),結(jié)果2份混合標(biāo)本均只擴(kuò)增出偽威氏按蚊的目標(biāo)條帶,結(jié)果見圖2。因此可以認(rèn)為2份混合樣本共20只多斑按蚊復(fù)合體其實(shí)僅包含偽威氏按蚊。

3 討 論

西藏林芝地區(qū)墨脫縣地理環(huán)境特殊,東臨察隅縣,南與印度薩蒂亞相連,西與米林、林芝縣相鄰,北與波密縣接壤,是全國(guó)唯一尚未通公路的縣。自1976年起該縣已有瘧疾發(fā)病報(bào)告,近年瘧疾發(fā)病呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì),但由于交通不便,通訊不暢以及缺乏專業(yè)瘧防人員,至今該地的傳瘧媒介尚未確定。

圖2 子孢子陽(yáng)性的混合樣本種型鑒定結(jié)果Fig.2 Result of species identification of pool samples with sporozoites positive

瘧疾流行區(qū)的傳瘧媒介判定工作是進(jìn)行瘧疾防治最為根本的基礎(chǔ),也是制定瘧疾綜合防治措施的前提。子孢子陽(yáng)性檢測(cè)是傳瘧媒介最為直接和有效的方法〔9〕,傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是人工解剖按蚊唾液腺發(fā)現(xiàn)子孢子,解剖人員需要經(jīng)過專業(yè)的培訓(xùn),并且耗時(shí),費(fèi)力。由于一般按蚊的子孢子自然感染率約為1～3‰左右〔10-11〕,所以若用唾液腺解剖方法來鑒定傳瘧媒介將耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間。

近年來,ELISA〔11-12〕和 PCR〔13-14〕方法已廣泛運(yùn)用于按蚊唾液腺內(nèi)的子孢子檢測(cè)。ELISA主要是檢測(cè)瘧原蟲子孢子的環(huán)子孢子蛋白(CSP),而PCR主要是用于擴(kuò)增子孢子基因組的一段特定的序列。兩種方法相比,PCR方法檢測(cè)子孢子的靈敏度和特異度均高于ELISA的方法〔15〕。普通PCR可以擴(kuò)增出僅10個(gè)子孢子〔16〕,而巢氏PCR能夠出僅含3個(gè)子孢子的蚊蟲DNA樣本〔4〕,可以用于少量的現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本檢測(cè),本研究采用混合樣本的方法〔4-5〕將PCR方法拓展到現(xiàn)場(chǎng)大量標(biāo)本的子孢子檢測(cè)研究。

偽威氏按蚊為泰國(guó)與緬甸邊境地區(qū)的傳瘧媒介〔17-18〕,本次研究現(xiàn)場(chǎng)為中國(guó)與緬甸邊境地區(qū)。董學(xué)書〔19〕也曾研究發(fā)現(xiàn)偽威氏按蚊的季節(jié)增長(zhǎng)與瘧疾的流行趨勢(shì)相一致。陸寶麟〔3〕曾報(bào)道威氏按蚊偏吸畜血,對(duì)瘧原蟲不明感,在瘧疾流行病學(xué)上意義不大;而偽威氏按蚊嗜吸人血,人血指數(shù)可達(dá)42.85%,對(duì)瘧原蟲非常敏感,與我國(guó)云南西雙版納地區(qū)的瘧疾流行關(guān)系密切。

子孢子rDNA是真核細(xì)胞較為保守的結(jié)構(gòu)基因,不同種屬的瘧原蟲SSUrRNA編碼基因的序列比較發(fā)現(xiàn),屬內(nèi)保守區(qū)和種間高度可變區(qū)間隔排列。瘧原蟲rDNA基因?yàn)槎嗫截惢?SSUrRNA在細(xì)胞中的含量極為豐富,故該基因被認(rèn)為是瘧原蟲基因檢測(cè)和種間鑒別理想靶基因。本研究采用混合樣本和巢氏PCR擴(kuò)增子孢子SSUrRNA,在360份混合樣本(3 600只按蚊)中檢測(cè)出2份標(biāo)本含有瘧原蟲的子孢子,并對(duì)2份樣本進(jìn)行種型鑒定發(fā)現(xiàn)其均為偽威氏按蚊,從而最終判定偽威氏按蚊為西藏瘧疾流行區(qū)的瘧疾傳播媒介。同時(shí)參照PCR子孢子檢測(cè)結(jié)果,偽威氏按蚊的子孢子自然感染率約為0.56‰(2/3600),雖然較低,但由于其數(shù)量巨大,種群密度高,依舊可以成為該地區(qū)的主要傳瘧媒介。

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Nested PCR identified the malaria vector in Tibet malaria endemic area

WU Song,H UANG Fang,ZHANG Guo-qing,PAN Jia-yun,WANG Xue-zhong,ZUOMA Yang-jin,HONG Yong-Hong,TANG Lin-hua
(Schoolof Integrated Traditional and Western Medicine of Anhui College of Chinese Traditional Medicine,Hefei230038,China)

To find the malaria vectorsin malaria-epidemic area in Linzhi district,Tibet,three villages with higher malaria incidence were selected as investigation spots.Human-baited traps,cow-baited traps,CDC light traps and morning collection were adopted to collect mosquitoes.M osquitoes were killed after identified asAnopheles maculatuscomplex and stored with desiccant at-20℃.DNA was extracted from mixed mosquito sample.SSU rDNA of sporozoites was amplified according to reference,and the positive products of PCR were cloned,sequenced and blasted for confirmation.Of 5 190 out of 5 345Anophelesmosquitoes wereAnopheles maculatuscomplex and the remainders wereAnopheles peditaeniatus.Two positive samples were foundin 360 mixedAnophelesmaculatuscomplex DNA samples,andidentified asAnopheles pseudowillmoriby species identification method.It＇s indicated thatAnopheles pseudowillmoriofAnopheles maculatuscomplex is the malaria vector in Linzhi malaria-endemic area.

Motuo;Anopheles maculatus complex;sporozoites;Malaria vector;Tibet;nested PCR

R531.3

A

1002-2694(2010)07-0648-03

*衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(200802021)、第五輪中國(guó)金全球基金疾病項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)施情研究(GF/M 5/2010-04)和安徽省優(yōu)秀青年教師基金(2009SQ RZ119)聯(lián)合資助

湯林華,Email:ipdtlh@public3.net.cn

1.安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院,合肥 230038;

2010-01-04;

2010-03-03