Apo CⅢ基因多態(tài)性在中國漢族健康人群中的分布特點及與不同種族人群的比較

俞 娟,褚少朋,楊曙梅,陳翠麗,景蓉蓉,王惠民*

(南通大學(xué)1.附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心;2.公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南通 226001)

Apo CⅢ基因多態(tài)性在中國漢族健康人群中的分布特點及與不同種族人群的比較

俞 娟1,2,褚少朋1,楊曙梅1,陳翠麗2,景蓉蓉1,王惠民1*

(南通大學(xué)1.附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心;2.公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南通 226001)

目的探討中國南通地區(qū)漢族人群載脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)基因多態(tài)性在健康人群中的分布特點,并與不同種族進(jìn)行比較研究。方法收集中國南通地區(qū)74名無血緣關(guān)系健康個體的靜脈血提取DNA,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)結(jié)合微流控電泳技術(shù),分別分析Apo CⅢ基因T-455C和C-482T的多態(tài)性。結(jié)果中國漢族人群Apo CⅢ-455C等位基因頻率明顯低于印度和哥斯達(dá)黎加人群(P＜0.01),與高加索和法國人群相似;中國漢族人群Apo CⅢ-482T等位基因頻率明顯高于法國人群(P＜0.01),與印度和高加索人群相似。結(jié)論Apo CⅢ基因T-455C和C-482T的多態(tài)性在健康人群分布具有種族差異。

載脂蛋白CⅢ;基因多態(tài)性;聚合酶鏈反應(yīng);限制性片段長度;微流控芯片電泳

R541.4

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0210)

載脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)由79個氨基酸殘基組成,其分子量為8.8 KD,主要在肝臟中合成,小腸中也有少量表達(dá)。Apo CⅢ通過抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL)以及受體活性影響血漿富含甘油三酯脂蛋白(TRL)的代謝。其基因定位于11q23,有4個外顯子和3個內(nèi)含子。由于Apo CⅢT-455C和C-482T這兩個多態(tài)性位于啟動子區(qū)的一個功能區(qū)域-胰島素反應(yīng)元件(IRE)(-490--449 bp)內(nèi),影響胰島素對Apo CⅢ表達(dá)的負(fù)性調(diào)控作用,從而易引發(fā)高甘油三酯血癥(HTG),而后者是冠心病(CHD)、動脈粥樣硬化等疾病的獨立危險因子。國外有許多學(xué)者對Apo CⅢ啟動子區(qū)IRE內(nèi)的T-455C和C-482T這兩個多態(tài)性進(jìn)行研究,但在不同種族人群中得出的結(jié)論不盡相同。本文研究中國南通地區(qū)漢族健康人群與不同種族人群的這兩個多態(tài)性,比較其頻率分布特征,為闡明Apo CⅢ基因多態(tài)性與HTG的關(guān)聯(lián)性提供遺傳和環(huán)境背景。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 74例健康人群來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心,診斷標(biāo)準(zhǔn)為[1]:甘油三酯(TG)＜1.7 mmol/L、膽固醇(Tch)＜5.17 mmol/L,均排除肝、腎、甲狀腺等疾病,其中女性37例,男性37例,年齡24-78歲,平均年齡40.49±10.5歲,均系南通地區(qū)、無血緣關(guān)系的漢族人群。

1.2 儀器與試劑 PTC-200型PCR擴增儀(MJ公司,美國)、Dolphin-Doc凝膠自動成像系統(tǒng)(WEALTEC,美國)、Caliper 1 000微流控電泳儀、微流控芯片、ME高分子膠(安捷倫,美國)、U-0080D核酸分析儀(日立,日本)、Taq DNA聚合酶購自上海生工(BBI分裝)、限制性內(nèi)切酶 BseGⅠ、MspⅠ(Fermentas)、dNTPs(南京生興)、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)φ X174DNA/HaeⅢ(立陶宛)、白細(xì)胞裂解液自制(10%SDS 10 ml,1 mmol/L Tris-HCl 5 ml,0.5 mmol/L EDTA 0.4 ml,加雙蒸水至100 ml,高壓滅菌,4℃保存)。Apo CⅢ上、下游引物自行設(shè)計,分別為:p1 5′GCACTCGCCTGCCTGGATT 3′,p2 5′TGAGTCCACGCTGCTGTCCC 3′,由上海生工公司合成及純化。

1.3 基因組DNA抽提 從1 ml EDTA抗凝外周血中提取有核細(xì)胞,用蛋白酶K和白細(xì)胞裂解液消化,然后用酚/氯仿/異戊醇法抽提DNA,溶于適量TE緩沖液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸的擴增 每個PCR擴增體系為50 μ l。其中包括基因組DNA 100 ng,10×PCR 緩沖液5 μ l(100 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L KCl,0.8%Nonidet P40),200 μ mol/L dNTPs,MgCl22.0 mmol/L,上下 游引物各0.1 μ mol/L,1.5 μTaq DNA 聚合酶 。擴增條件:95℃預(yù)變性 3 min,94℃30 s、60℃40 s、72℃30 s,共33個循環(huán),最后72℃延伸5 min。

1.5 產(chǎn)物鑒定及分析

1.5.1 -455位點用瓊脂糖凝膠電泳方法 PCR產(chǎn)物用BseGⅠ于55℃消化2小時,3.0%瓊脂糖凝膠中(含溴化乙錠0.5 μ g/ml)電泳 1小時,凝膠自動成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.5.2 -482位點用微流控芯片電泳方法 PCR產(chǎn)物用MspⅠ于37℃消化3小時,進(jìn)行微流控芯片電泳。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 Apo CⅢ-455位和-482位基因頻率及基因型頻率用直接計數(shù)法,不同地區(qū)、不同人種Apo CⅢ基因頻率的構(gòu)成比用 χ2檢驗進(jìn)行比較,所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計由Stata8.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 Apo CⅢ基因多態(tài)性結(jié)果 用引物行PCR擴增反應(yīng)可獲得Apo CⅢ啟動子區(qū)長度為413 bp的一段產(chǎn)物(圖1)。

2.1.1 T-455C多態(tài)性基因型的判別 擴增產(chǎn)物經(jīng)BseGI作用后(酶切位點為 5′GGATGNN ↓′3 或 3′CCTAC↑NN′5),產(chǎn)生三種酶切結(jié)果:(1)-455TT純合子時,擴增的基因片段,含有BseGⅠ酶切位點,可被完全酶切為123 bp、290 bp兩條區(qū)帶;(2)-455TC雜合子時,產(chǎn)生不完全酶切,出現(xiàn)123 bp、290 bp、413 bp三條區(qū)帶;(3)-455CC純合子時,其PCR產(chǎn)物經(jīng)BseGⅠ消化,不產(chǎn)生酶切,則電泳后只出現(xiàn)413 bp一條區(qū)帶(圖2)。

2.1.2 C-482T多態(tài)性基因型的判別 擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspI作用后(酶切位點為 5′C↓CGG′3或3′GGC↓C′5),產(chǎn)生三種酶切結(jié)果:(1)-482CC純合子時,可見315 bp、82 bp和16 bp三條帶;(2)-482TT純合子時,可見331 bp和82 bp兩條帶;(3)-482CT雜合子時,則可見331 bp、315 bp、82 bp和 16 bp四條帶。然而在對酶切產(chǎn)物進(jìn)行微流控芯片電泳分型過程中,由于16 bp的核酸序列太短,與定量標(biāo)記15 bp條帶只相差一個堿基,因此兩者很難分離開,但這并不影響結(jié)果的判定(圖3)。

圖1 Apo CⅢPCR擴增產(chǎn)物

圖2 Apo CⅢ-455位酶切產(chǎn)物

圖3 Apo CⅢ-482位酶切產(chǎn)物微流控芯片電泳圖譜

2.2 不同種族健康人群Apo CⅢ基因及基因型頻率比較

2.2.1 Apo CⅢ-455位 中國南通地區(qū)漢族健康人群Apo CⅢ-455CC基因型頻率明顯低于印度和哥斯達(dá)黎加人群(P＜0.01),而與高加索和法國人群相似;-455C等位基因頻率也明顯低于印度和哥斯達(dá)黎加人群(P＜0.01),與高加索和法國人群相似(表1)。

表1 不同種族人群Apo CⅢ-455位基因及基因型頻率比較[n(%)]

2.2.2 Apo CⅢ-482位 中國南通地區(qū)漢族健康人群Apo CⅢ-482TT基因型頻率明顯高于法國人群(P＜0.01),與中國北京、中國浙江、印度和高加索人群相似,-482T等位基因頻率也明顯高于法國人群(P＜0.01),與中國北京、中國浙江、印度和高加索人群相似(表2)。

表2 不同種族人群Apo CⅢ-482位基因及基因型頻率比較[n(%)]

3 討論

Apo CⅢ基因定位于人類11號染色體,與Apo AⅠ、AⅣ基因緊密相連,共同組成一個基因家族。在轉(zhuǎn)人Apo CⅢ基因小鼠中,血漿中Apo CⅢ過度表達(dá)并引起HTG[2],但可被apoE基因的過度表達(dá)所校正;在Apo CⅢ基因敲除的小鼠中,由于Apo CⅢ缺乏,不會引起餐后HTG[3];在動物和培養(yǎng)的細(xì)胞中Apo CⅢ基因表達(dá)可被胰島素下調(diào)[4],從而使TG穩(wěn)定在一定水平。IRE內(nèi)基因突變體丟失了這個功能,導(dǎo)致Apo CⅢ基因?qū)σ葝u素的調(diào)節(jié)不反應(yīng)。缺乏胰島素調(diào)節(jié)會導(dǎo)致Apo CⅢ的過度表達(dá)并促進(jìn)HTG的發(fā)展。但在對其IRE內(nèi)多態(tài)性此兩位點與TG的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn),不同種族人群中得出的結(jié)論不盡相同,如在加拿大人和法國女性[7]中觀察到相關(guān),在印度人群中更明顯[5],而在荷蘭的家族性混合HTG家系中并沒有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)。但Olivieri[6]等研究了冠心病(CHD)和代謝綜合癥(MS)與T-455C多態(tài)性的關(guān)系并發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。Guettier[7]等也發(fā)現(xiàn)T-455C多態(tài)性與MS有相關(guān)性。Miller等建議將啟動子區(qū)的這個多態(tài)性作為亞洲印度人群中預(yù)測CHD風(fēng)險的標(biāo)志物[8]。

本文研究中國南通地區(qū)漢族人群與不同種族人群的Apo CⅢT-455C多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)中國南通地區(qū)漢族正常人群Apo CⅢ-455CC基因型頻率明顯低于印度[5]和哥斯達(dá)黎加人群[8](P＜0.01),而與高加索[5]和法國人群[7]相似;-455C等位基因頻率也明顯低于印度和哥斯達(dá)黎加人群(P ＜0.01),與高加索和法國人群相似。

C-482T位點,是Apo CⅢ基因啟動子區(qū)另一多態(tài)性位點,國內(nèi)外許多學(xué)者對其進(jìn)行了研究。Talmud等[9]研究顯示,Apo CⅢ基因C-482T多態(tài)性位點與血漿TG水平相關(guān);Waterworth等[10]也證明Apo CⅢ基因C-482T多態(tài)性與血漿TG水平有相關(guān)性,且與吸煙有相互作用;Jaroslav等在捷克人群中發(fā)現(xiàn),男性人群中-482T純合子攜帶者具有較高的血漿TG水平。在加拿大人群與法國女性人群中也發(fā)現(xiàn)有這種相關(guān)性[7],在印度人群中尤其顯著[5]。但國內(nèi)學(xué)者畢楠等發(fā)現(xiàn)Apo CⅢC-482T位點多態(tài)性與冠心病無相關(guān)性[11],而李國平等在健康體檢人群中卻觀察到Apo CⅢC-482T多態(tài)性與TG有相關(guān)性[12]。

本文研究發(fā)現(xiàn),中國南通地區(qū)漢族健康人群Apo CⅢ -482TT基因型頻率明顯高于法國人群(P＜0.01),與中國北京[11]、中國浙江[12]、印度和高加索人群相似,-482T等位基因頻率也明顯高于法國人群(P＜0.01),與中國北京、中國浙江、印度和高加索人群相似。

本課題組已對Apo CⅢ基因啟動子區(qū)多態(tài)性與HTG的相關(guān)性作了研究,并得出相關(guān)性結(jié)論[13,14],但由于-455位多態(tài)性在國內(nèi)其他地區(qū)未見報道,因而無法在國內(nèi)進(jìn)行地區(qū)性比較,而-482位多態(tài)性在中國北京、中國浙江已有研究,其等位基因和基因型頻率與本文無顯著性差異,但明顯高于法國人群。而由于病種和對象人群的選擇標(biāo)準(zhǔn)不同,對患者組的基因頻率和基因型頻率則較難進(jìn)行比較。

本文的研究結(jié)果與有些文獻(xiàn)報道不同甚至相反,這種不一致有可能反映了遺傳素質(zhì)在種族間的差異,也在一定程度上解釋了為什么不同種族HTG的發(fā)病率不一致。同時以上結(jié)果也說明,雖然存在種族差異及遺傳背景的不同,Apo CⅢ基因多態(tài)性在不同種族HTG發(fā)病機制的遺傳因素中均發(fā)揮著重要作用。這也在一定程度上解釋了為什么印度人發(fā)生與脂質(zhì)代謝混亂相關(guān)性疾病如冠心病(CHD)的概率高,是否與其-455C等位基因頻率顯著高于其他種族人群有關(guān)呢。攜帶有變異等位基因的所謂“健康人群”,若干年后是否會發(fā)病,發(fā)病的概率是多少呢,對這些進(jìn)行跟蹤研究很有意義。中國是多民族國家,研究不同民族人群基因多態(tài)性,可以嘗試從基因角度解釋為什么有些地區(qū)或民族患與脂質(zhì)代謝混亂相關(guān)性疾病的概率高,這對高基因風(fēng)險人群進(jìn)行篩選,臨床進(jìn)行提前干預(yù),對HTG和CHD等心血管疾病的預(yù)防具有積極意義。同時對研究不同種族人群的易患疾病進(jìn)行分析研究打下一定基礎(chǔ)。

以上結(jié)果分析表明,在分析Apo CⅢ基因多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)性時必須充分認(rèn)識種族特異性對疾病易感性的影響。

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Comparative study of polymorphism distribution of Apo CⅢgene between Chinese Han healthy population and different races

YU Juan,CHUShao-peng,YANGShu-mei,et al.(Laborotry Medicine Center,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong226001,China)

ObjectiveTo investigate the polymorphism distribution ofApo CⅢgene betweenChinese Han population and different races.MethodsDNA samples were extraced from 74 EDTA blood of unrelated healthy individuals.Apo CⅢalleles were typed using polymerase chain reaction-restrication fragment length polymorphism(PCR-RFLP)combining microfluidic chip electrophoresis.ResultsThe alleles frequencies of Apo CⅢ-455T was lower significantly in Chinese Han population than in the Indian and Costa Rica population(P＜0.01);The alleles frequencies of Apo CⅢ-482T was higher significantly in Chinese Hanpopulation than in the White race(P＜0.05).ConclusionThere exist ethnic difference in the distribution of Apo CⅢ-455C and-482T alleles in healthy individuals.

Apolipoprotein CⅢ;Genetic polymorphism;Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism;Microfluidic chip electrophoresis

1007-4287(2010)02-0210-04

江蘇省醫(yī)學(xué)重點學(xué)科資助(XK200723),南通大學(xué)自然科學(xué)項目(08Z057)

*通訊作者,E-mail:ntfyjyk@pubnt.jsinfo.net

俞娟(1974-),女,醫(yī)學(xué)碩士,主管技師,主要從事臨床免疫學(xué)檢驗和分子生物學(xué)研究。

2009-01-16)