肝素結(jié)合細胞因子Midkine與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤生物學(xué)特征和BRAF突變的關(guān)系

寶榮，王欣，王佾，關(guān)海霞

（1.重慶市第九人民醫(yī)院 病理科，重慶 400700；2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，沈陽 110001）

甲狀腺癌是人類最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，組織學(xué)上可分為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）、濾泡狀癌 （follicular thyroid cancer，F(xiàn)TC）、髓樣癌（medullar thyroid cancer，MTC）和未分化癌等，其中PTC占所有甲狀腺癌的80%～85%。近年來，PTC已經(jīng)成為發(fā)病率增加最快的惡性腫瘤之一［1］。尋找有助于診斷PTC和評估其預(yù)后的標(biāo)志物對PTC臨床治療策略的制定至關(guān)重要。本研究擬通過探討肝素結(jié)合細胞因子Midkine（MK）在PTC中的表達及其與腫瘤生物學(xué)特征的關(guān)系，研究MK表達與PTC中的重要基因突變——BRAF基因突變［2］的關(guān)系，為PTC臨床診治策略的制定提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2002年至2006年在菏澤市立醫(yī)院行手術(shù)治療的PTC病例100例（男17例，女83例，年齡16～66歲，平均年齡45歲）；甲狀腺腺瘤病例30例（男9例，女21例，年齡25～65歲，平均年齡48歲），以及癌對側(cè)正常甲狀腺組織20例（男3例，女17例，年齡17～57歲，平均年齡43歲）。上述標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林浸泡固定，石蠟包埋，4 μm切片。對PTC病例，收集其腫瘤生物學(xué)特征資料，包括腫瘤的甲狀腺外侵襲情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［3］。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：免疫組化染色采用SP法。MK抗體購自美國Abcam公司，SP試劑和AEC顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。陽性對照采用已知的陽性對照片，陰性對照使用磷酸鹽緩沖液代替一抗進行，所有對照均與研究標(biāo)本在同一條件下進行染色。采用雙盲法判定MK陽性表達，以腫瘤細胞膜、胞質(zhì)出現(xiàn)淡紅色至深紅色顆粒為陽性。全部細胞均無顯色為0分；弱陽性或散在中等強度陽性顯色為1分；散在強陽性顯色或大部分細胞中等強度陽性顯色為2分；大部分細胞強陽性顯色為3分。

1.2.2BRAF突變檢測：石蠟組織切片經(jīng)二甲苯處理、蛋白酶K消化后，用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿提取術(shù)和乙醇沉淀法將DNA分離出來。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)對標(biāo)本DNABRAF基因的第15外顯子進行擴增，上游引物序列為［4］：5′TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3′，下游引物序列為：5′GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3′。擴增后的產(chǎn)物經(jīng)過Big Dye循環(huán)反應(yīng)后進行直接測序（ABI PRISM 3730基因測序儀，加拿大）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。分類數(shù)據(jù)采用頻率和百分數(shù)表示，連續(xù)變量應(yīng)用±s表示。分類變量的假設(shè)檢驗應(yīng)用χ2檢驗，連續(xù)變量的假設(shè)檢驗應(yīng)用t檢驗。P值采用雙側(cè)檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MK在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤及PTC中的表達

MK在正常甲狀腺組織中不表達，在甲狀腺腺瘤和PTC中表達的陽性率分別為6.7%和87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。MK僅在2例甲狀腺腺瘤中有散在的細胞胞質(zhì)呈弱陽性顯色，而在絕大多數(shù)PTC中大部分細胞的胞質(zhì)呈中等強度至強陽性顯色（圖1）。甲狀腺腺瘤和PTC中MK表達染色評分均值分別為0.07和1.98，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表 1。

表1 MK在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤及PTC中的表達Tab.1 Expression ofMKin tumor-adjacent normaltissue，thyroid adenoma，and papillary thyroid cancer

2.2 MK表達與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤生物學(xué)特征的關(guān)系

MK在PTC中的表達水平與患者性別無關(guān)。在具有惡性程度較高的腫瘤生物學(xué)特征（甲狀腺腺外侵襲、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期Ⅲ/Ⅳ期）的PTC中，MK表達的強陽性率和染色評分均有明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 PTC中MK表達與BRAF突變的相關(guān)性

100例PTC標(biāo)本中，T1799ABRAF突變率為63%（圖2）。30例甲狀腺腺瘤和20例正常甲狀腺組織中，未檢出BRAF基因突變。

如表2所示，攜帶T1799ABRAF突變的PTC病例和攜帶野生型BRAF基因的PTC病例中，MK表達的陽性率分別為94%（59/63）和76%（28/37），有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），MK的表達平均評分分別為2.22和1.62，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

表2 MK與PTC腫瘤生物學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between MKexpression and clinicopathologicalcharacteristics ofpapillary thyroid cancer

3 討論

1988 年，Kadomatsu 等［5，6］發(fā)現(xiàn)了一個新的肝素結(jié)合生長因子MK。人MK基因定位于11p11.2，該基因上游有視黃酸應(yīng)答因子的位點NF-κB結(jié)合位點及固醇類/甲狀腺激素受體結(jié)合位點。MK的功能首先被定位于神經(jīng)細胞的發(fā)育及分化，隨后人們發(fā)現(xiàn)它也是一種多功能的生長因子［7，8］。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，往往有許多生長因子及其下游的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)參與其中［9］。MK作為一種生長因子，正常情況下在成年人各組織器官中不表達或表達水平很低，但在許多腫瘤組織中卻發(fā)現(xiàn)了MK的高表達。1993 年，Tsutsui等［10］發(fā)現(xiàn)在 Wilm′s腫瘤、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及食管癌的癌組織中MK的表達較癌旁組織均有不同程度的增高。1996年，O′Brien等［11］發(fā)現(xiàn)98%的腫瘤和70%的正常組織中表達MKmRNA，但前者的表達中值比后者高4倍。Nakanishi等［12］和 Miyashiro等［13］也報道了卵巢癌和乳腺癌中有MK高表達。但是，有關(guān)MK在甲狀腺癌中表達的研究很少。

PTC是最常見的甲狀腺癌類型，盡管其臨床進展相對緩慢，但是仍有相當(dāng)比例的患者因甲狀腺腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等影響了生活質(zhì)量和疾病預(yù)后。因此，研究者們一直在尋找有助于確定PTC診斷和評估患者預(yù)后的指標(biāo)。近年來的研究確定了PTC發(fā)生發(fā)展中的重要分子事件——BRAF基因突變。這一突變能引起B(yǎng)RAF蛋白第600位密碼子的纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔M而導(dǎo)致BRAF激酶和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路的持續(xù)活化［2］。轉(zhuǎn)基因鼠的實驗已經(jīng)證實了BRAF突變的致PTC作用［14］。對多個臨床研究的薈萃分析提示此突變與PTC的預(yù)后較差有關(guān)［2］。

本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測了PTC中MK的表達，分析其表達的特異性及其與腫瘤生物學(xué)特征的相關(guān)性；同時還檢測了PTC中BRAF基因突變的情況，探討了MK表達與這一提示不良預(yù)后的突變之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，MK在正常甲狀腺組織中不表達，在個別良性甲狀腺腺瘤中僅有散在弱陽性表達，而在PTC組織中，無論是表達陽性率和染色強度均明顯增加。這一結(jié)果與Kato等［15］的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)MK的表達與PTC的腫瘤生物學(xué)特征相關(guān)。在惡性程度較高，如伴有腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期Ⅲ/Ⅳ期的腫瘤組織中，MK的表達明顯高于惡性程度較低的病例。此外，MK的表達強度與BRAF突變也明確相關(guān)，發(fā)生突變的病例MK表達顯著增加。MK在PTC中表達的特異性較高，并且與較高的腫瘤惡性特征相關(guān)，提示MK在PTC的發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要的作用。另外，與BRAF突變相比，MK在PTC中表達的陽性率更高，而且免疫組化方法比基因測序在臨床上實用性更強，因此MK作為臨床協(xié)助診斷PTC和評估PTC預(yù)后的指標(biāo)之一，具有更好的應(yīng)用前景。

［1］Davies L，Welch HG.Increasing incidence of thyroid cancer in the United States，1973-2002［J］.JAMA，2006，295（18）：2164-2167.

［2］Xing M.BRAF mutation in papillary thyroid cancer：pathogenic role，molecular bases，and clinical implications［J］.Endocr Rev，2007，28（7）：742-762.

［3］Cooper DS，Doherty GM，Haugen BR，et al.Management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer［J］.Thyroid，2006，16（2）：109-141.

［4］Guan H，Ji M，Bao R，et al.Association of high iodine intake with the T1799A BRAF mutation in papillary thyroid cancer［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94（5）：1612-1617.

［5］KadomatsuK，TomomuraM，MuramatsuT.cDNAcloningandsequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis［J］.Biochem Biophys Res Commun，1988，151（3）：1312-1318.

［6］Tsutsui J，Uehara K.Kadomatsu K，et al.A new family of heparinbinding factors：strong conservation of midkine （MK）sequences between the human and the mouse［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991，176（2）：792-797.

［7］Muramatsu T.Midkine （MK），the product of a retinoic acid responsive gene，and pleiotrophin constitute a new protein family regulating growth anddifferentiation［J］.IntJDevBiol，1993，37（1）：183-188.

［8］Muramatsu H，Shirahama H，Yonezawa S，et al.Midkine，a retinoic acid-inducible growth/differentiation factor：immunochemical evidence for the functionand distribution［J］.Dev Biol，1993，159（2）：392-402.

［9］Aaronson SA.Growthfactorsandcancer［J］.Science，1991，254（5035）：1146-1153.

［10］Tsutsui J，Kadomatsu K，Matsubara S，et al.A new family of heparin binding growth/differentiation factors：increased midkine expression in Wilms′tumorandotherhumancarcinomas［J］.CancerRes，1993，53（6）：1281-1285.

［11］O′Brien T，Cranston D，F(xiàn)uggle S，et al.The angiogenic factor midkine is expressed in bladder cancer，and over-expression correlates withapooroutcomeinpatientswithinvasivecancers［J］.Cancer Res，1996，56（11）：2515-2518.

［12］Nakanishi T，Kadomatsu K，Okamoto T，et al.Expression of midkine andpleiotropininovariantumors［J］.ObstetGynecol，1997，90（2）：285-290.

［13］Miyashiro I，Kaname T，Shin E，et al.Midkine expression in human breast cancers：expression of truncated form［J］.Breast Cancer Res Treat，1997，43（1）：1-6.

［14］KnaufJA，MaX，SmithEP，etal.Targetedexpressionof BRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation［J］.Cancer Res，2005，65（10）：4238-4245.

［15］Kato M，Maeta H，Kato S，et al.Immunohistochemical and in situ hybridization analyses of midkine expression in thyroid papillary carcinoma［J］.Mod Pathol，2000，13（10）：1060-1065.