應(yīng)用10對引物多重PCR方法檢測DMD基因缺失

林長坤，姜懿凌，王謙，曹東華，崔婉婷，金春蓮

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室；2.第91期7年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，沈陽 110001）

Duchenne型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種較常見的X連鎖隱性遺傳病，其發(fā)病率約為活產(chǎn)男嬰的1/3 500，臨床表現(xiàn)以肌肉的進(jìn)行性萎縮和無力為特征。該病發(fā)病早，進(jìn)展快，患者多于20歲前死亡。目前尚無有效的治療方法，只能通過對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，以杜絕患兒的出生。致病基因肌營養(yǎng)不良蛋白基因定位于X染色體短臂（Xp21.1-3），它是目前已知的人類最大的基因，全長約為2.4 Mb，由79個外顯子和78個內(nèi)含子構(gòu)成，具有較高頻率的突變。在所有突變中，基因缺失最為常見，約占55%～65%，基因重復(fù)占5%～10%，點(diǎn)突變占25%左右?；蛉笔е饕娪?個缺失熱區(qū)：5′端的第4～21外顯子（占缺失的20%）及第44～52外顯子（占缺失的54%～60%）。近年來，Chamberlain 等［1］、Beggs等［2］、Abbs等［3］在2個缺失熱點(diǎn)區(qū)設(shè)計了外顯子引物，建立了檢測本病基因缺失的多重PCR方法。我們在DMD基因缺失熱點(diǎn)區(qū)域外顯子45～53和外顯子12～19之間，根據(jù)文獻(xiàn)選取10對引物，首次對我國東北地區(qū)55例DMD患者進(jìn)行了肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺失檢測，并建立了10對引物的多重PCR方法，研究了基因缺失規(guī)律，探討了改進(jìn)措施，從而進(jìn)一步完善了DMD的基因診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

55例DMD患者均來自我國東北地區(qū)，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科門診確診，均具有典型的臨床表現(xiàn)，并經(jīng)肌電圖、血清肌酸磷酸激酶檢查確診。全部患者均為男性，年齡5～14歲，平均7歲。另選取正常健康者5例作為對照。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取方法：抽取患者及正常對照者外周血3 ml，采用飽和氯化鈉方法［4］提取DNA。

1.2.2 多重PCR擴(kuò)增及電泳檢測及結(jié)果判定：根據(jù)文獻(xiàn)［1～3］提供的引物序列，由上海生工生物工程公司合成肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺失熱點(diǎn)區(qū)第45、19、51、12、50、13、53、47、42、52 外顯子的 10 對引物（表1）。分別將患者和正常人的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μl，其中包含模板DNA 500 ng，0.4 mmol/L dNTPs，每對引物各 0.5 μmol/L，5 U Taq DNA聚合酶，對應(yīng)的2.5×緩沖溶液。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，57℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取15 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳條件為1×TBE電泳緩沖溶液、80 V、電泳2.5 h，以100 bp DNA Ladder作為分子量參照。EB染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。與正常人DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，無特異性擴(kuò)增條帶者判定為基因缺失，對未見到擴(kuò)增條帶的外顯子進(jìn)行再次多重PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證缺失結(jié)果，若結(jié)果相同，即未見到特異性擴(kuò)增條帶者則判定為肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子缺失。

表1 10對多重PCR引物序列及PCR產(chǎn)物片段大小Tab.1 The primers′sequences and product size of multiplex-PCR for the detection of DMD gene deletion

2 結(jié)果

如圖1所示，10對外顯子引物在同一個PCR反應(yīng)體系中可同時擴(kuò)增出10個特異性片段，并且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，易于判斷。在檢測的55例DMD患者中，28例（50.9%）存在外顯子缺失，27例（49.1%）未檢測到缺失；25例缺失片段集中于第45～53外顯子，3例缺失片段集中于第12～19外顯子。第50外顯子缺失頻率最高，其次為外顯子45、47、51、52，再次之為外顯子 12、53；而外顯子 13、19缺失頻率較低，未檢測到外顯子42的缺失。外顯子缺失數(shù)見表2。

3 討論

我們在前期研究中，曾應(yīng)用3×4對引物（共12對）的多重PCR方法進(jìn)行了DMD的基因診斷，發(fā)現(xiàn)DMD患者肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子的缺失絕大部分位于中央?yún)^(qū)的缺失熱點(diǎn)區(qū)域，其中外顯子45～53缺失約占總?cè)笔У?7.8%［5］，因此，將此區(qū)域的多個外顯子組合為1組，首先對DMD患者進(jìn)行缺失檢測，如果這些引物檢測到至少有1個外顯子的缺失，就可診斷為缺失型DMD；如果這些引物未檢測到缺失，再選擇其它引物組合（外顯子8～19）對其它外顯子進(jìn)行檢測可進(jìn)一步明確DMD診斷。這樣既能降低成本，又能快速做出DMD的基因診斷。本研究從肌營養(yǎng)不良蛋白基因的缺失熱區(qū)（外顯子12～19，42～53）選取了 10 對引物，應(yīng)用多重 PCR 技術(shù)首次對55例東北地區(qū)DMD患者進(jìn)行了肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺失檢測。結(jié)果顯示，至少有1個外顯子缺失的患者28例，占總數(shù)的50.9%；27例未檢測到缺失，占49.1%。肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺失主要分布于2個外顯子缺失的熱點(diǎn)區(qū)內(nèi)：25例缺失片段位于第45～53外顯子，3例缺失片段位于第12～19外顯子。第50外顯子缺失頻率最高，其次為外顯子45、47、51、52，再次為外顯子 12、53，而外顯子 13、19最低，未檢測到外顯子42的缺失。本研究中DMD患者的外顯子缺失片段分布規(guī)律與文獻(xiàn)報道基本一致，符合缺失熱點(diǎn)區(qū)域的分布規(guī)律。本文建立的10對多重PCR方法與應(yīng)用3×4對引物的多重PCR方法相比，檢測結(jié)果一致，而操作上更為簡便，能夠快速有效的檢測出DMD基因缺失熱點(diǎn)區(qū)域的絕大部分外顯子的缺失，并進(jìn)一步明確了缺失范圍，為下一步診斷工作節(jié)省了時間。另外，選取DMD基因缺失2 個熱點(diǎn)區(qū)域（外顯子 12～19，42～53）的引物互為內(nèi)對照，避免了因操作所造成的假陰性結(jié)果，同時各外顯子的電泳條帶也更容易判斷。

表2 缺失外顯子分布統(tǒng)計Tab.2 The deletion status of exons

本研究檢測了多個參數(shù)來優(yōu)化10對引物的多重PCR方法，以獲得高特異性的、高產(chǎn)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。首先，選擇組合的引物長度相差最小為30 bp左右，以確保擴(kuò)增的10個特異性PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰、易于判斷；其次，調(diào)整PCR反應(yīng)體系中的緩沖溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物的濃度，以達(dá)到最大的擴(kuò)增效率，避免了因操作所造成的假陰性結(jié)果而誤診。研究結(jié)果表明，10對PCR引物的組合可在同一個PCR循環(huán)條件下、同一個反應(yīng)管中快速擴(kuò)增出所有目的條帶（PCR反應(yīng)僅需幾個小時，而DNA印跡雜交則一般需要1～2周）；操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用（只需常規(guī)PCR試劑，費(fèi)用低、無放射性污染）；能有效檢測出高頻缺失外顯子（45～53，8～19）的特異性片段。10對多重PCR方法的建立更加完善了現(xiàn)有的檢測方法，更有利于達(dá)到預(yù)防患兒出生的目的，對提高我國人口素質(zhì)，優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。

［1］Chamberlain JS，Gibbs RA，Ranier JE，et al.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification［J］.Nucleic Acids Res，1988，16（23）：11141-11156.

［2］Beggs AH，Koenig M，Boyce FM，et al.Detection of 98%of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction ［J］.Hum Genet，1990，86（1）：45-48.

［3］Abb S，Yan SC，Clark S，et al.A convenient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions ［J］.J Med Genet，1991，28（10）：304-311.

［4］林長坤，姜莉，張勵，等.一種實(shí)用的基因組DNA提取方法及其應(yīng)用［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，27（4）：440-442.

［5］魯陽，金春蓮，林長坤，等.東北地區(qū)抗肌營養(yǎng)不良蛋白基因缺失的研究及應(yīng)用［J］.遺傳學(xué)報，2004，31（5）：449-453.