抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷免疫組化檢測(cè)的研究

王心童,王虹蛟,王 強(qiáng),孟威宏,顏煒群,任立群

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春解放軍第461醫(yī)院;3.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院;4.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所)

抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷免疫組化檢測(cè)的研究

王心童1,王虹蛟2,王 強(qiáng)2,孟威宏3,顏煒群4*,任立群4

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春解放軍第461醫(yī)院;3.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院;4.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所)

目的 探討抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響。方法利用實(shí)驗(yàn)鼠的四氯化碳(CCl4)急性肝損傷模型,同時(shí)給予抑肽酶觀察其對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力改變。結(jié)果各治療組與模型組相比,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加(P＜0.05),隨著抑肽酶劑量的增加,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目也增加。結(jié)論抑肽酶能夠促進(jìn)急性肝損傷肝細(xì)胞增殖,并隨著劑量的增加而增加。

抑肽酶;四氯化碳;急性肝損傷;小鼠,免疫組織化學(xué)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1176)

本論文利用實(shí)驗(yàn)鼠的四氯化碳(CCl4)急性肝損傷模型,同時(shí)利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)方法觀察抑肽酶對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠,雌雄兼用,由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心提供,合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第1055113。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠急性CCl4肝損傷模型的建立 健康昆明種小鼠6-8周齡,體重20-23 g,雌雄各半。正常對(duì)照組僅腹腔注射花生油20 ml/kg,其它各實(shí)驗(yàn)組小鼠按20ml/kg腹腔注射0.1%CCL4花生油。禁食,不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 取昆明種小鼠60只(體重20-23 g,雌雄各半),隨機(jī)分為 6組,每組 10只。第1組為正常對(duì)照組(空白組):腹腔注射等量生理鹽水。第2組為CCl4中毒模型組(模型組):腹腔注射等量生理鹽水。第3組為抑肽酶小劑量組:腹腔注射抑肽酶3萬(wàn)KIU/kg。第4組為抑肽酶中劑量組:腹腔注射抑肽酶6萬(wàn)KIU/kg。第5組為抑肽酶大劑量組:腹腔注射抑肽酶12萬(wàn)KIU/kg。第6組為甘利欣注射液組(陽(yáng)性組):腹腔注射甘利欣10mg/kg。

第3-5組小鼠每天注射抑肽酶1次,第6組小鼠每天注射甘利欣1次,連續(xù)7天。第7天給藥完畢后,第1組小鼠腹腔注射花生油20ml/kg,第2-6組小鼠按20m l/kg腹腔注射0.1%CCL4花生油。禁食,不禁水。18小時(shí)后再給藥1次。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 末次給藥1小時(shí)后處死小鼠,取肝大葉相同部位的一小塊肝組織固定于10%福爾馬林,常規(guī)方法制做組織切片。

(1)脫蠟與修復(fù):石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水(二甲苯洗2次,每次30分鐘;無(wú)水乙醇洗2次,每次10分鐘;95%乙醇洗2次,每次5分鐘;80%乙醇洗1次,5分鐘),自來(lái)水洗2次之后,將切片置枸櫞酸鹽修復(fù)液(A液9ml,B液41ml,加蒸餾水至500ml)中加熱至98℃進(jìn)行修復(fù);

(2)切片冷卻至40℃以下,滴加3%H2O2室溫處理15分鐘,以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,用PBS沖洗3次,每次5分鐘;

(3)滴加正常兔血清封閉液,室溫孵育30分鐘,甩去多余的液體(勿洗);

(4)滴加兔抗人PCNA單克隆抗體(稀釋度1∶100),4℃過(guò)夜,PBS沖洗3次,每次5分鐘;(5)滴加二抗,室溫孵育20分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘;

(6)滴加三抗,室溫孵育20分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘;

(7)3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色1分鐘,自來(lái)水中止發(fā)色;

(8)蘇木素輕度復(fù)染5分鐘,弱氨水返藍(lán)10秒鐘,自來(lái)水沖洗;

(9)脫水、透明及封片:80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ及100%乙醇Ⅱ脫水各5分鐘;二甲苯透明2次,每次5分鐘;樹(shù)膠封片。

結(jié)果判定:200倍顯微鏡下每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,各組之間數(shù)據(jù)比較均采用兩組資料秩和檢驗(yàn)的方法。

2 結(jié)果

應(yīng)用增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear-Antigen簡(jiǎn)稱PCNA)抗體,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCNA表達(dá)情況,評(píng)測(cè)各組肝細(xì)胞增殖情況。200倍顯微鏡下每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示?？瞻捉M中,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為3±1個(gè)/視野(圖1);模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5±2個(gè)/視野(圖2);抑肽酶小劑量組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為15±7個(gè)/視野(圖3);抑肽酶中劑量組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為21±10個(gè)/視野(圖4);抑肽酶大劑量組為40±15個(gè)/視野(圖5);甘利欣組中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為27±10個(gè)/視野(圖6);各劑量組與模型組相比,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加(P＜0.05),隨著抑肽酶劑量的增加,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目也增加。說(shuō)明抑肽酶能夠促進(jìn)急性肝損傷肝細(xì)胞增殖,并隨著劑量的增加而增加。

圖1 空白組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為3±1個(gè)/視野200×

圖2 模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5±2個(gè)/視野200×

圖3 抑肽酶小劑量組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為15±7個(gè)/視野200×

圖4 抑肽酶中劑量組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為21±10個(gè)/視野200×

圖5 抑肽酶大劑量組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為40±15個(gè)/視野200×

圖6 甘利欣陽(yáng)性組陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為27±10個(gè)/視野200×

3 討論

肝臟是機(jī)體最大的代謝器官和消化腺體,從胃腸道吸收的物質(zhì)幾乎均要進(jìn)入肝臟,在肝臟內(nèi)進(jìn)行合成、分解、轉(zhuǎn)化、儲(chǔ)存。肝臟同時(shí)也是機(jī)體重要的免疫器官。各種致病因子作用于肝組織后,可直接導(dǎo)致肝細(xì)胞不同程度的損害,還可通過(guò)自分泌和旁分泌作用引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的激活,引起肝細(xì)胞的損傷、再生、肝纖維化等,晚期則發(fā)展為肝功能衰竭。關(guān)于肝損傷機(jī)制及對(duì)其保護(hù)作用的研究,是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)之一[1-6]。

肝損傷動(dòng)物模型的建立是篩選保肝藥物的關(guān)鍵步驟之一。CCl4致肝損傷是目前普遍應(yīng)用的肝損傷模型[7]。CCl4肝損傷分急、慢性兩種,CCl4的肝毒性主要表現(xiàn)為血清中轉(zhuǎn)氨酶活性增加,肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化或壞死,其轉(zhuǎn)歸有肝細(xì)胞增殖,損傷恢復(fù)或肝纖維化兩個(gè)方面。近年來(lái),隨著自由基和細(xì)胞因子,粘附分子研究的不斷深入,對(duì)CCl4肝毒性的研究也取得了一些進(jìn)展。①自由基清除劑的變化:CCl4進(jìn)入機(jī)體后,經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活,生成三氯甲基自由基(CCl3?)和三氯甲基過(guò)氧自由基(OOCCl3?),這兩種自由基引起肝細(xì)胞的各種變化導(dǎo)致肝損傷。②GSH的作用:CCl4進(jìn)入機(jī)體后,經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活,生成三氯甲基自由基(CCl3?)和三氯甲基過(guò)氧自由基(OOCCl3?),這兩種自由基引起肝細(xì)胞的各種變化導(dǎo)致肝損傷。③肝損傷過(guò)程中細(xì)胞因子的變化:急性肝損傷后,單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)和單核細(xì)胞的滲透有直接的關(guān)系,MCP-1的表達(dá)先于單核細(xì)胞的募集,用維生素E預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)分子的產(chǎn)生,可使MCP-1的表達(dá)和釋放減少[8]。④粘附分子的變化:上調(diào)和炎癥細(xì)胞的積累可能是CCl4肝毒性產(chǎn)生的關(guān)鍵[9]。

增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell NuclearAntigen簡(jiǎn)稱PCNA)由Miyachi等于1978年在SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名,因其只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)而得名,以后的研究發(fā)現(xiàn)PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切,在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用,是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測(cè)了個(gè)實(shí)驗(yàn)組中肝細(xì)胞PCNA表達(dá)情況,以評(píng)測(cè)各組細(xì)胞增殖狀態(tài)。結(jié)果顯示與模型組相比,抑肽酶各劑量組與模型組相比,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加,隨著抑肽酶劑量的增加,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目也增加。說(shuō)明抑肽酶能夠促進(jìn)急性肝損傷肝細(xì)胞增殖,并隨著劑量的增加而增加。

抑肽酶是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑。其主要作用有:①抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、白細(xì)胞水解酶,抑制血小板聚集和粘附等作用,廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療[10];②是血清酶和緩激肽釋放酶抑制劑,在高纖溶狀態(tài)下發(fā)揮抗纖溶作用,但在纖溶狀態(tài)降低時(shí)能防止術(shù)后早期纖溶狀態(tài)降低;③有保護(hù)血小板功能,減少術(shù)后出血,縮短創(chuàng)面滲血時(shí)間和穩(wěn)定血液動(dòng)力學(xué)等作用[11];④抑肽酶還有抑制炎性介質(zhì)釋放的作用[12],預(yù)防細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制白細(xì)胞過(guò)度激活及炎性介質(zhì)的釋放,阻斷細(xì)胞因子炎性介質(zhì)與白細(xì)胞之間的惡性循環(huán)作用,減輕再灌注對(duì)機(jī)體組織器官功能的損傷。

綜上所述,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)方法觀察抑肽酶對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響,表明腹腔注射抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠急性肝損傷的具有明顯的保護(hù)作用。推測(cè)抑肽酶是急性肝炎和肝病治療的一種新的、有效的方法,具有重大的科研及臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Immunohistochemistrory detection of the in fluence of ap rotinin on theW istar ratswith acute liver injury

WANGXin-tong,WANGHong-jiao,WANGQiang,etal.(1.Norman Bathune College ofMedicine,Jilin University,Changchun130021,China;2.The461Hospital of PLA;3.TheGeneral Hospitalof Shenyang Military District;4.The Instituteof Frontier Medical Science,Jinlin University)

ObjectiveTo investigate the influence of ap rotinin on the hepatocyte proliferation inWistar ratswith acute liver injury.MethodsTheacutehepatic injurymodelof ratswere induced by carbon tetrachloride(CCl4)and aprotininwas administered to rats.The influence ofaprotinin on the hepatocyte proliferation inWistar ratswith acute liver injury was observed.ResultsCompare withmodel group,the numberof positive cells increased significantly in every treatmentgroup(P＜0.05).With the increase of the dose of aprotinin,the numberof positive cells also increased.ConclusionThe aprotinin could promote the p roliferation of liver cells in acute damage livermodel.

Aprotinin;Carbon tetrachloride;Acute hepatic injury;Rats;Electronmicroscope

R575

A

1007-4287(2010)08-1176-03

國(guó)家自然基金課題(課題編號(hào)30300153)

*通訊作者

2009-03-11)