腺苷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的腦保護作用

白建梅 劉宏志 譚 軍

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453003 2)天津市第一中心醫(yī)院內(nèi)科 天津 300011 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453003

腦血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)尤其是缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascu lar diseases,ICVD)是神經(jīng)系統(tǒng)常見病及多發(fā)病。腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致多種因素引起神經(jīng)細胞死亡,因此采用神經(jīng)保護劑減輕腦缺血再灌注損傷日益受到人們的重視。眾多實驗研究表明,腺苷具有腦保護作用。本實驗運用腺苷進行預(yù)處理,觀察腦缺血再灌注后腦組織病理變化,應(yīng)用免疫組化方法觀察對Bax蛋白表達的影響,進一步揭示腺苷的腦保護作用機制,為臨床治療提供一條思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(270±20)g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為假手術(shù)組(F組)、缺血再灌注組(IR組)、腺苷預(yù)處理組(AP組),每組20只,依術(shù)后處死動物時間的不同,每組再分為4個亞組:2 h、6 h、24 h 和 72 h 組(F 2、6、24、72 h,IR 2、6、24、72 h,AP 2、6、24、72 h),每個亞組5只動物。假手術(shù)組和缺血再灌注組于手術(shù)前3 d經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 mL,1次/d,共3次。腺苷預(yù)處理組術(shù)前3 d經(jīng)腹腔注射腺苷注射液,1.5 mg?kg-1,生理鹽水稀釋至2 mL,1次/d,共3次。

1.2 主要藥品及主要試劑 腺苷注射液(adenosine injection)主要成分為腺苷(化學(xué)名稱為 6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-H-嘌呤:6 mg/2 mL),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H 20030320,生產(chǎn)廠家:沈陽光大制藥有限公司。Bcl-2抗體購于Santa C ruz Biotechno logy.Inc;PV-6001免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 。

1.3 缺血再灌注模型建立[1]10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠,暴露并分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外(ECA)和頸內(nèi)(ICA)動脈,電凝頸外動脈的分支甲狀腺上動脈、咽升動脈、ICA與ECA間的交通動脈,結(jié)扎ICA分支翼腭動脈(PPA)。將前端涂有指甲油的尼龍線由ECA插入,經(jīng)CCA入ICA。尼龍線插入深度(18.5±0.5)mm。缺血2 h后將栓線拉出至ECA實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插線栓外,其余步驟同上。實驗中保持大鼠體溫(37±0.5)℃至蘇醒。

1.4 病理觀察 各組大鼠用10%水合氯醛(0.17 mL/100 g)深麻醉后,先以生理鹽水再以4%多聚甲醛快速心臟灌注,取視交叉前后各2 mm的腦組織塊在多聚甲醛中固定、脫水透明,石蠟包埋后切片,片厚 4μm,行HE染色,光鏡觀察。其余腦組織切片行Bax免疫組化染色。

1.5 Bax免疫組化檢測 步驟:(1)將烤好的切片脫蠟、水化。(2)胰蛋白酶修復(fù)液進行抗原修復(fù)30 min。(3)3%H2O2,室溫孵育10 m in。(4)滴加一抗(Bax 1∶150),4℃過夜。(5)滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫下孵育30 m in。(6)DAB顯色。(7)蒸餾水終止反應(yīng),封片。Bax陽性細胞的胞漿染成棕黃色。應(yīng)用HPIAS-2000顯微圖像處理系統(tǒng)采集圖片,每張切片隨機取5個高倍鏡視野(400×),計數(shù)Bax陽性細胞數(shù),取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 HE染色病理觀察 光鏡下假手術(shù)組腦組織皮層內(nèi)未見壞死區(qū)域,神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常,間質(zhì)致密無水腫。缺血再灌注組大鼠腦組織顯示大腦皮質(zhì)有壞死區(qū),壞死區(qū)可見大量變性死亡的神經(jīng)元、神經(jīng)元層次排列紊亂,較多呈篩狀壞死的壞死灶,神經(jīng)細胞明顯減少,殘存神經(jīng)細胞胞體縮小變形,核固縮,神經(jīng)元纖維疏松,間質(zhì)水腫明顯。腺苷預(yù)處理組大鼠右側(cè)腦組織顯示病灶皮質(zhì)染色稍淺,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)基本正常,間質(zhì)水腫較輕。

光鏡觀察可以看出,假手術(shù)組見神經(jīng)細胞形態(tài)正常,無損傷的形態(tài)學(xué)表現(xiàn);缺血再灌注組神經(jīng)細胞損傷嚴(yán)重,腺苷預(yù)處理組較缺血再灌注組損傷輕,說明腺苷預(yù)處理可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)細胞損傷的程度,對神經(jīng)細胞損傷有保護作用。

圖1 缺血再灌注組6 h Bax陽性細胞×200

圖2 腺苷預(yù)處理組6 h Bax陽性細胞×200

圖3 缺血再灌注組24 h Bax陽性細胞×200

圖4 腺苷預(yù)處理組24 h Bax陽性細胞×200

2.2 Bax免疫組化結(jié)果 陽性結(jié)果:Bax陽性細胞胞漿中有棕黃色顆粒表達。陰性對照:在腦組織壞死區(qū)及缺血半暗帶區(qū)均未見有棕黃色顆粒表達的Bax陽性細胞。F組缺血中心區(qū)僅見微量的Bax表達。IR組再灌注2 h腦組織缺血中心區(qū)可見棕黃色顆粒的Bax陽性細胞明顯表達。隨后逐漸增多,于24 h表達水平最高;隨著再灌注時間延長,Bax表達開始減少,但仍保持較高水平。見圖1、2。AP組再灌注2 h腦組織缺血中心區(qū)可見棕黃色顆粒的Bax開始表達,24 h達高峰;隨后逐漸減弱。見圖3、4。各時間點Bax陽性細胞表達均低于IR組。見表1。

表1 不同時間各組大鼠腦組織內(nèi)Bax的表達(±s)

表1 不同時間各組大鼠腦組織內(nèi)Bax的表達(±s)

注:與F組比較,●P＜0.05;與 IR組比較,□P＜0.05;IR和AP組同一組內(nèi)各時間點比較,■P＜0.05

組別 2 h 6 h 24 h 72 h F 組 2.80±0.837 2.40±0.548 2.40±1.140 2.60±1.140 IR 組 12.20±2.387●癇 17.80±3.114●癇 32.40±1.817●癇 23.00±3.536●癇AP 組 6.80±1.483●□癇 11.60±2.702●□癇 23.20±2.280●□癇 15.80±1.643●□癇

Bax陽性細胞胞漿中有棕黃色顆粒表達,主要分布在缺血中心區(qū),且各組大鼠腦組織Bax陽性細胞表達不同,假手術(shù)組表達不明顯,缺血再灌注組表達較高,腺苷預(yù)處理組逐漸較少。同一時間點Bax陽性細胞細胞表達IR組和AP組與F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);AP組與IR組比較有顯著差異(P＜0.05);同一組內(nèi)各時間點比較,F組各亞組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),IR組和AP組組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 Bax蛋白的表達

3 討論

缺血再灌注損傷是臨床上常見的基本病理生理過程,人們對它進行了大量的相關(guān)研究[2-4]。腦缺血可誘導(dǎo)腺苷釋放,與A 1受體結(jié)合導(dǎo)致K-ATP通道開放可能參與腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)的形成[5]。腺苷能抑制興奮性氨基酸的釋放,降低細胞膜對鈣離子的通透性,擴張腦血管,抑制炎性細胞黏附和浸潤,抑制血小板聚集,減輕炎性細胞、自由基介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷,其作用是受特異性腺苷受體調(diào)節(jié),腺苷受體分為 A1、A2、A 3三種。在全腦-全腦模式中預(yù)處理時藥物阻斷A1受體或K-ATP通道能阻斷IP的誘導(dǎo)。CIP對大鼠海馬神經(jīng)元的缺血再灌注保護作用接近100%,而應(yīng)用腺苷A1受體拮抗劑可以完全阻斷CIP的保護作用,因此推測CIP通過腺苷A 1受體介導(dǎo)。

腺苷或谷胱甘肽預(yù)先注入大鼠靜脈可明顯增加大鼠心臟、肝臟ATP含量,減少自由基生成,提高動物存活率[6]。心臟和腦缺血預(yù)處理的保護作用具有相似性,均為促進內(nèi)源性腺苷釋放誘導(dǎo)CIP樣保護作用。本實驗光鏡觀察到預(yù)處理組腦部損傷輕,證實局灶性腦缺血再灌注時應(yīng)用腺苷可明顯減輕腦組織的不可逆損害,再次表明腺苷具有確切的腦保護作用。

最新研究表明腦缺血再灌注損傷與細胞凋亡及其調(diào)控基因密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng),現(xiàn)已知與凋亡相關(guān)的基因基本上分為兩大類[7]:一類是促進細胞凋亡的基因,如 Bax、BalxS、cFos等;另一類是抑制凋亡的基因,如 Bcl-2和 BclxL等。Bcl-2家族中的成員共同調(diào)節(jié)細胞凋亡[8]。其中兩種主要的調(diào)節(jié)基因即Bcl-2基因和Bax基因表達的變化被眾多學(xué)者認為是腦缺血后細胞凋亡的主要分子機制[9]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因,Bax則是與之拮抗的促凋亡基因,實驗發(fā)現(xiàn)這兩種基因的相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物即Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的變化對凋亡的進程有著直接影響。

Bax是一種由192個氨基酸殘基組成的,相對分子質(zhì)量為21000的蛋白質(zhì),與Bcl-2的同源性為21%,但Bax與Bcl-2的作用完全相反,Bax的表達并不立即導(dǎo)致細胞凋亡,而是僅在細胞接受死亡信號之后Bax才開始發(fā)揮作用,通過抑制Bcl-2的作用而導(dǎo)致細胞凋亡。Bcl-2屬于拮抗細胞凋亡的基因,它既能阻抑壞死又能阻抑凋亡[10-11],而這兩種死亡又是腦缺血損傷的主要形式。在本實驗研究中,大鼠局灶性腦缺血及再灌注2 h促凋亡基因蛋白Bax開始表達,再灌注6 h明顯增高,至24 h達到高峰,幾乎在相同的時間和相同的腦區(qū),Bax陽性神經(jīng)元變性程度重,形態(tài)變化大,提示Bax參與了缺血后神經(jīng)元凋亡的過程。同時我們還可以發(fā)現(xiàn)用腺苷預(yù)處理后大鼠腦組織促凋亡蛋白Bax明顯減少;與假手術(shù)組和缺血再灌注組相比,腺苷預(yù)處理組各時間點Bax蛋白表達減少顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明應(yīng)用腺苷進行預(yù)處理可以明顯降低促凋亡基因Bax蛋白的表達,從而發(fā)揮腦保護作用,提示腺苷用于腦缺血治療具有廣泛前景。

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