豬偽狂犬病診斷檢測方法的研究進展及應用

邢俊玲 高付城 （山東省武城縣畜牧水產(chǎn)局 253300）

近年來，全世界的畜類受到傳染的病毒種類和數(shù)量都有所增加，其中豬偽狂犬病毒就是其中一種。根據(jù)研究證明其屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型(Su1d HerpesviruS I，SHv-I)，可引起包括豬在內(nèi)的多種家畜和野生動物共患一種急性傳染病。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重，主要引起的臨床癥狀有：仔豬高熱，中樞神經(jīng)病狀及較高死亡率，成年豬則長期潛伏感染，成為保毒宿主和主要的傳染源。世界上40多個國家均有本病的報道發(fā)生，國內(nèi)也有大范圍的流行，對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本文主要對血清學、分子生物學診斷與檢測方法，以及鑒別診斷方法進行了綜述。

1 臨床診斷和病理組織學檢測

成年豬無明顯癥狀，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉震顫，嚴重時四肢劃水樣運動，體溫升高達41～42℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞可檢出A型核內(nèi)包涵體。

2 病原學診斷技術(shù)

此種方法也被稱為診斷PRV的黃金標準。病毒分離時可以采集病豬的組織有：腎臟、腦、肝、脾及扁桃體，勻漿后加上雙抗，接種到敏感細胞，直至出現(xiàn)特征性細胞病變(CPE)。這種方法的敏感性較差[1]。

3 核酸探針檢測技術(shù)

探針技術(shù)由于其具有特異性良好、敏感程度高的優(yōu)點，廣泛用于PRV的診斷和檢測中。Rirtle等首次使用核酸探針技術(shù)鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學的研究資料。其后，用生物素和地高辛標記的探針從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出PRV DNA，并進行了原位雜交，從單細胞的水平上檢出存在的潛伏感染 (Maes等)。國內(nèi)也存在利用探針檢測技術(shù)的研究，采用32P探針標記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應用斑點雜交技術(shù)，從而獲取培養(yǎng)物中的PRV存在的信息，能檢測出10pg的PRV–DNA，并具有較高的特異性(郭萬柱等1991)[2]。

4 聚合酶鏈式反應(PCR)檢測技術(shù)

4.1 常規(guī)PCR 80年代建立成熟起來的PCR技術(shù)，不僅給分子生物學的基礎(chǔ)理論帶來重大的進展，也給檢測病毒提供了方便快捷的新技術(shù)，因為其快速、特異、敏感，且安全可靠等明顯優(yōu)勢，在檢測豬偽狂犬病毒方面得到了廣泛應用。目前，主要根據(jù)病毒生存必須的糖蛋白基因和毒力基因為模板設(shè)計引物，檢測的基因片段主要有g(shù)B、gD、gG和gE等，其中g(shù)D基因是該病毒的主要中和抗原基因。如Echeverria M G等以PRVgD 基因為模板設(shè)計了一對引物，利用PCR法對19頭豬的組織樣本進行了檢測，結(jié)果表明有15頭PCR反應陽性，而病毒分離只得到了3株P(guān)RV。周復春等應用PCR技術(shù)進行了PRV的檢測，并對潛伏的感染部位也進行了相應的研究。其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%[3]。石建平等對常規(guī)PCR法進行了改進，提高PCR的效率，使PCR技術(shù)更趨于實用化，根據(jù)gD 基因設(shè)計一對引物，選用高速離心和短時間100℃水浴釋放模板，將試驗縮短到 4h 內(nèi)完成[4]。2009年，陳本龍等根據(jù)gD 基因設(shè)計引物，成功建立了檢測PRV的PCR體系[5]。

4.2 鑒別PCR Katz等根據(jù)gE、TK基因設(shè)計的套式PCR能將PRV野毒株和不同疫苗株有效地鑒別開[6]。劉麗娜等設(shè)計了與PRV的gB、gD、gE基因的3對引物，建立了能有效區(qū)分野毒株和基因缺失疫苗毒的多重PCR診斷方法，敏感性試驗結(jié)果表明，多重PCR可以檢測到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PRV野毒的核酸模板量[7]。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA是目前最為廣泛應用的一種免疫檢測方法，也是被國際貿(mào)易制定檢測PRV的方法之一。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學和酶促生化反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定實驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗適用于實驗室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學調(diào)查和無本病健康豬群的建立，目前，國際上有各種商品化ELISA試驗盒出售。

Moutn(1978)[8]，Afshar(1987)[9]等分別建立了檢測偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法。國內(nèi)蔣玉雯等(1988)[10]建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學調(diào)查。

5.1 gE-ELISA gE-ELISA是一種靈感度很高的ELISA，它是根據(jù)疫苗株缺失的糖蛋白構(gòu)建的一種鑒別ELISA。荷蘭學者 Van Oirschot 等(1988，1989)建立了檢測 PRV gE抗體的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(gE-ELISA)。Herdchek公司和gE抗體檢測試劑盒是一種阻斷gE-ELISA，該方法是一種阻斷gE-ELISA，由于涉及到全病毒，因此存在一定的安全隱患，結(jié)合基因工程的發(fā)展，給新型gE-ELISA的發(fā)展和建立提供了思路，Kimman等(1996)將一段gE基因(60-1020bp)融合到PRVgG的信號序列下游，在昆蟲細胞中獲得表達，并以該表達產(chǎn)物和一種抗gE的單抗建立一種間接雙抗夾心gE-ELISA。

5.2 gC–ELISA gC是PRV病毒的一種主要糖蛋白但并不是病毒感染所必需的，能夠誘導細胞免疫應答且為病毒的主要中和抗原之一。Kit等利用牛傳染性鼻氣管炎病毒基因缺失株(IBRV)作為載體表達，gC作包被糖原，建立了gC–ELISA。該方法和許多種檢測方法比較，證明此方法特異敏感。Van Oirschot等ELISA和中和試驗檢測感染豬血清，進行比較后發(fā)現(xiàn)，gC–ELISA和gE-ELISA方法較為敏感。

5.3 gG-ELISA Marchioli和Cook等建立了阻斷gG-ELISA技術(shù)，該方法較常規(guī)ELISA方法敏感性低。唐勇等利用gG-ELISA區(qū)分出gG基因缺失疫苗豬和野毒感染豬。

6 乳膠凝集實驗技術(shù)(LA)

乳膠試驗凝集技術(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應血清反應，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。王澤州等于2001年報道利用此種方法對四川省的20個豬場進行了血清檢測，陽性率為14.7%，少數(shù)豬場陽性率達到95%。羅勇等利用乳膠凝膠實驗技術(shù)對疑似豬瘟病的病豬進行了豬偽狂犬病毒的檢測，230份血清中陽性率11%[11]。

7 血清中和實驗技術(shù)(SNT)

SN是檢測病毒比較經(jīng)典的血清學方法，應用比較方便，很多國家都采用此法檢測PRV。Boelaert F等應用SN對比利時北部地區(qū)4個豬場的母豬進行了血清學調(diào)查，血清陽性率分別為68%、60%、43%、18%[12]。李曉慧等采用SN和LAT兩種方法對吉林省8個地區(qū)1050份血清進行了檢測，確定吉林省PR血清陽性率為21.7%，兩種方法血清檢出率經(jīng)統(tǒng)計學分析準確性差異不顯著[13]。邱德新等應用血清中和實驗(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實驗(LAT)診斷試劑盒進行了PRV抗體效價測定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果符合率高，特異性強，LAT比SNT敏感、快速簡便和實用[14]。

8 瓊脂免疫擴散試驗(AGID)

Gutekunst D E(1997)首次報道了利用微量瓊擴試驗檢查豬血清中PRV抗體，由于AGID技術(shù)操作簡單。結(jié)果準確，無需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢，因此適用于基層獸研單位和大型豬場的現(xiàn)場的定性診斷及豬群隱形無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進行了比較試驗，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等(2002)利用AGID技術(shù)對5個豬場進行了抗體檢測，結(jié)果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，再一次顯示了AGID 技術(shù)的簡便和快捷[15]。

9 結(jié)語

目前，可以用來診斷豬PRV的多種檢測手段中，傳統(tǒng)檢測手段可靠，但往往操作較復雜，或耗時較長，實際應用中有一定的困難。血清學檢測手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡單，方便，不需要使用昂貴復雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和一毛免疫動物，但一些ELISA方法還不夠完善。分子生物學方法特別是PCR技術(shù)，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡便、快速、實用。建立和完善用于我國的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫(yī)科研工作者面臨的重大課題之一。

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