犬卵母細(xì)胞體外成熟的研究進(jìn)展

王倫學(xué)，李 力，谷穎東，徐永莉，張?jiān)略疲w成堅(jiān)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所廣西分所 廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

犬卵母細(xì)胞體外成熟的研究進(jìn)展

王倫學(xué)，李 力，谷穎東，徐永莉，張?jiān)略?，趙成堅(jiān)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所廣西分所 廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

闡述了影響犬卵母細(xì)胞體外成熟的各種因素，總結(jié)概括了目前新的培養(yǎng)方法，并對(duì)國內(nèi)的研究現(xiàn)狀及前景作了思考，以期為研究犬卵母細(xì)胞體外成熟研究提供參考。

犬；卵母細(xì)胞；減數(shù)分裂；體外成熟；輔助生殖技術(shù)

目前，犬卵母細(xì)胞體外成熟效率很低[1-13]。據(jù)報(bào)道，犬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂比例為0～58%，而發(fā)育至MⅡ期比例平均為20%[14]。犬卵母細(xì)胞體外成熟所采用的培養(yǎng)液大多借鑒其它家畜動(dòng)物，如豬和牛的體外成熟系統(tǒng)，而很少研究考慮犬種屬特異性。犬體外成熟體系與其它哺乳動(dòng)物相比仍不完善，這可能與犬卵母細(xì)胞具有不同的體外成熟機(jī)理有關(guān)。目前已有較多報(bào)道嘗試采用不同培養(yǎng)基，在其中添加蛋白質(zhì)、黏多糖及輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，但卵母細(xì)胞體外發(fā)育至MⅡ期比例仍無大幅度提高。因此，若要發(fā)展犬體外受精和胚胎發(fā)育等輔助生殖技術(shù)，必須提高犬卵母細(xì)胞體外成熟效率。本文綜述了影響犬卵母細(xì)胞體外成熟因素及目前采用的培養(yǎng)方法，為深入探索優(yōu)良的體外培養(yǎng)體系作參考。

1 影響因素

1.1 卵母細(xì)胞質(zhì)量和直徑

研究發(fā)現(xiàn)，犬卵巢中存在很高比例（20%～68%）的退化卵母細(xì)胞[13]。Farstad W等在1993年發(fā)現(xiàn)高達(dá)68%的犬卵母細(xì)胞發(fā)生形態(tài)退化，不能用于體外成熟?？赡芘c犬年齡及發(fā)情周期及卵母細(xì)胞分離方法有關(guān)。犬卵母細(xì)胞多數(shù)采用手術(shù)刀片切碎卵巢組織而分離獲得，卵母細(xì)胞多數(shù)是從卵巢組織內(nèi)卵泡中獲取的。分離過程中可能對(duì)卵泡和卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)有機(jī)械損傷。另外，從屠宰場(chǎng)或?qū)櫸镝t(yī)院獲取的犬卵巢多數(shù)處于間情期，卵巢表面充滿皺褶且無明顯卵泡。卵母細(xì)胞全是從卵巢內(nèi)卵泡中分離到的，分離出的卵母細(xì)胞多數(shù)已發(fā)生退化，可用于體外成熟的卵母細(xì)胞數(shù)量有限。僅少數(shù)研究抽吸卵巢表面卵泡中卵母細(xì)胞用于研究，用此方法獲取的卵母細(xì)胞質(zhì)量較高。所以卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量是制約犬卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)展的重要因素[15]。

在其它哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟能力與卵泡直徑[16-19]和卵母細(xì)胞直徑有關(guān)[20，21]。目前，Hewitt和England發(fā)現(xiàn)直徑最大組（＞100μm）卵母細(xì)胞成熟能力大于直徑中等組（100μm），直徑中等組卵母細(xì)胞成熟能力大于直徑小組（＜100μm）。T Otoi等在2000年研究發(fā)現(xiàn)，直徑大于等于120 μm組卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ期達(dá)到21.5%，顯著高于直徑小于100 μm組（0%）以及直徑為100～120 μm組（4.9%）[22]。此研究表明卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力與卵母細(xì)胞直徑大小成正比。此研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)直徑小于100 μm的卵母細(xì)胞不能發(fā)育至MⅡ期，而卵母細(xì)胞直徑達(dá)120 μm才具有減數(shù)分裂能力。這表明卵母細(xì)胞直徑可作為衡量體外成熟（IVM）效率的一個(gè)重要指標(biāo)。另外，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力可能與培養(yǎng)體系有關(guān)。而目前體外培養(yǎng)體系不成熟及成熟效率普遍低下，因此很難評(píng)估不同直徑卵母細(xì)胞體外成熟能力。

N Songsasen[23]從直徑小于2 mm卵泡中獲取卵母細(xì)胞，卵丘細(xì)胞為2層或以上并且細(xì)胞質(zhì)黑而均勻的卵母細(xì)胞用于體外成熟。分離出的卵母細(xì)胞直徑可達(dá)120 μm，與體內(nèi)的卵母細(xì)胞直徑相同[24]，并具有充分的發(fā)育能力。但是，卵母細(xì)胞體外成熟卻停滯在第1次減數(shù)分裂中期（MⅠ），他們推測(cè)這與卵泡直徑有關(guān)，而與卵母細(xì)胞直徑無關(guān)。此研究表明從直徑大于2 mm卵泡中獲取卵母細(xì)胞用于體外成熟是最佳選擇。

1.2 供體因素

1.2.1 生殖周期

多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，犬卵母細(xì)胞成熟能力與生殖周期無關(guān)[25-28]。其中，DAHewitt和GCWEngland發(fā)現(xiàn)發(fā)情前期和發(fā)情期之間，以及間情期和發(fā)情后期之間卵母細(xì)胞體外成熟能力差異不顯著[25]。M Hishimuma等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情間期（8.8%）和子宮積膿期（6.0%）卵巢中卵母細(xì)胞體外成熟72 h后，發(fā)育至MⅡ比例差異不顯著。Berenice de Avila Rodrigues等報(bào)道從子宮積膿期卵巢獲取的1級(jí)和2級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ期的比例與其它生殖周期相似[29]。其中子宮積膿期卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ期比例低至10%，這與其他幾篇報(bào)道結(jié)果類似[10，11，27，28]。另外，Berenice de Avila Rodrigues[28]發(fā)現(xiàn)各生殖周期間卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力差異不顯著[28]（卵泡期：5.4%；間情期：4.2%；發(fā)情后期：4.4%；子宮積膿期：8.1%；妊娠期：4.7%），恢復(fù)減數(shù)分裂能力（GVBD-MⅡ）之間亦差異不明顯（卵泡期：24.6%；間情期：19.6%；發(fā)情后期：16.4%；子宮積膿期：37.1%；妊娠期：29.2%）。

僅有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)犬卵母細(xì)胞成熟能力與生殖周期有關(guān)。MK Kim等在體外成熟液中添加17β-雌二醇（E2）和孕酮（P4），檢測(cè)其對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟的影響[30]。卵泡期卵母細(xì)胞在添加2μg/mL的17 β-雌二醇的TCM-199成熟液中培養(yǎng)后，發(fā)育至MⅡ比例（14.7%）顯著高于（P＜0.05）發(fā)情后期（5.6%）和間情期（5.6%）卵母細(xì)胞，并且也顯著高于其它組（1.5%～8.2%）。表明不同發(fā)情周期卵母細(xì)胞體外成熟能力與成熟液成分有關(guān)。

1.2.2 月份和季節(jié)

Nucharin Songsasen等統(tǒng)計(jì)各季節(jié)（春季：3～5月份；夏季：7～8月份；秋季：9～11 月份；冬季:12至次年2月份）卵母細(xì)胞成熟能力，其發(fā)育至MⅡ比例分別是 20.8±4.7%，20.5±2.8%，23.8±4.7%，17.8±5.2%。此研究表明月份和季節(jié)不影響狗卵母細(xì)胞體外成熟能力（P＞0.05）[31]。

1.2.3 年齡

D A Hewitt等比較不同年齡犬卵巢中卵母細(xì)胞成熟能力大小[32]，發(fā)現(xiàn)1～6歲犬卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂能力（67%）大于7歲或年齡更大組（34%），同時(shí)1～6歲犬卵母細(xì)胞完成核成熟能力（MI/AI/MⅡ：25%）亦大于7歲或年齡更大的（4%）。隨年齡增大，卵巢組織更加老化，其卵母細(xì)胞質(zhì)量越低，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力越小。若要提高犬卵母細(xì)胞體外成熟效率，需優(yōu)先選擇年齡較小犬的卵巢組織中卵母細(xì)胞。

1.3 激素

1.3.1 孕酮

孕酮（P4）是多數(shù)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子。已有較多研究表明孕酮對(duì)卵母細(xì)胞成熟有積極或消極作用。如Gould和Graham研究發(fā)現(xiàn)孕酮能促進(jìn)恒河猴卵母細(xì)胞體外成熟至MⅡ能力[33]。而DeMarais和Racowsky發(fā)現(xiàn)孕酮對(duì)倉鼠卵母細(xì)胞成熟有抑制作用[34]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度孕酮使小鼠卵母細(xì)胞處于減數(shù)分裂停滯狀態(tài)[35]。

有關(guān)孕酮對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用研究不多，且不同研究所得結(jié)論不一致。如Hewitt在體外成熟液中添加1.0μg/mL孕酮，能促進(jìn)犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)能力[5]。而Willingham-RockyLA等發(fā)現(xiàn)添加高濃度孕酮（從0～8 000 ng/mL），對(duì)犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)以及核成熟都沒有顯著促進(jìn)作用[36]。MKKim等發(fā)現(xiàn)孕酮能刺激（P＜0.05）犬卵泡期卵母細(xì)胞體外核成熟至MⅡ能力[30]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，含E2（2μg/mL）的培養(yǎng)液中添加孕酮（0～2.0μg/mL）與單獨(dú)添加E2相比，能進(jìn)一步促進(jìn)或抑制卵母細(xì)胞核成熟。其中低濃度孕酮（0.5μg/mL）顯著降低卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力（3.4%），而高濃度孕酮（2μg/mL）能顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力（16.6%）。此研究表明，孕酮對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用可能依賴于很多因素，如培養(yǎng)基中添加的激素。

1.3.2 hCG

Monica De los Reyes等采用分段培養(yǎng)方法研究hCG對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟作用。此研究中分段培養(yǎng)即卵母細(xì)胞首先在含10 IU/mL的hCG培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，然后在不含hCG培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞在含10 IU/mL的hCG培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)96 h，其發(fā)育至MⅡ比例（MⅡ：33.1%）高于未添加hCG組（MⅡ：20.7%），但差異不顯著。同時(shí)發(fā)現(xiàn)采用上述分段培養(yǎng)法，卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ比例高達(dá)43.4%，明顯高于對(duì)照組。此研究是犬卵母細(xì)胞體外成熟效率較高的報(bào)道之一[12]。但hCG對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟作用機(jī)制仍不清楚。

1.3.3 eCG，F(xiàn)SH和LH

N Songsasen等發(fā)現(xiàn)犬卵母細(xì)胞在eCG中短暫處理能促進(jìn)其發(fā)育MⅠ期及以后時(shí)期。他們把犬卵母細(xì)胞放置在eCG中處理60～240 min，能顯著提高卵母細(xì)胞發(fā)育至 MⅠ-MⅡ比例（P＜0.05）[23]。其中，用0.5 IU/mLeCG處理60～240 min，有30%～44%卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ-MⅡ，而對(duì)照組（無eCG處理組）僅有14%發(fā)育至MⅠ-MⅡ。但eCG處理120 min對(duì)照組相比，卵母細(xì)胞發(fā)育至GV，GVBD和MⅠ-MⅡ比例都差異不顯著。作者認(rèn)為這是由于不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)中卵母細(xì)胞對(duì)eCG反映不同所導(dǎo)致的。

上述eCG對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)作用機(jī)制沒有研究清楚。eCG對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)作用可能是通過FSH活性產(chǎn)生的。已報(bào)道小鼠和豬卵母細(xì)胞中FSH能刺激卵丘細(xì)胞分泌減數(shù)分裂刺激物質(zhì)[37，38]而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。Byskov A G等發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞在FSH中處理30 min能促進(jìn)GVBD發(fā)生[37]，F(xiàn)SH作用24 h能促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)和核成熟。但已有研究表明，在培養(yǎng)液中添加FSH/LH（單獨(dú)或聯(lián)合作用），都不能促進(jìn)犬卵母細(xì)胞成熟[5，7，11]，這可能與促性腺激素作用導(dǎo)致雌激素/孕酮比例改變有關(guān)。Ding和Foxcroft發(fā)現(xiàn)成熟液中添加促性腺激素能改變豬顆粒細(xì)胞類固醇激素合成比例[39]，其中雌激素/孕酮比例改變。而成熟液中雌激素/孕酮比例變化能影響一些物種卵母細(xì)胞核成熟能力[7，39，40]。因此，建議下步實(shí)驗(yàn)可以研究犬卵母細(xì)胞在激素作用下（短暫處理或者較長(zhǎng)時(shí)間作用）顆粒細(xì)胞合成激素濃度變化，以此來探索激素是如何影響犬卵母細(xì)胞成熟能力的。

1.4 卵丘細(xì)胞

在各種家畜動(dòng)物中，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）中卵丘細(xì)胞擴(kuò)展被認(rèn)為是卵母細(xì)胞成熟的一個(gè)重要指標(biāo)[41，42]。因此，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展可被認(rèn)為是犬卵母細(xì)胞成熟的一個(gè)標(biāo)志。但研究發(fā)現(xiàn)犬卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)卵丘細(xì)胞很少發(fā)生擴(kuò)展[43，44]，并且體內(nèi)卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間聯(lián)系從受精至桑葚胚期持續(xù)存在[45]。已報(bào)道藍(lán)狐卵母細(xì)胞體外成熟過程中卵丘擴(kuò)展規(guī)律與犬相同，這可能是由于藍(lán)狐與犬在親緣關(guān)系較近。因此犬科動(dòng)物卵丘擴(kuò)展具有特殊性[11，46]，可能是由于其卵母細(xì)胞質(zhì)成熟不充分[47]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)犬科動(dòng)物卵丘細(xì)胞擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟不成正比關(guān)系[11，46]。如Srsen等發(fā)現(xiàn)FSH能刺激狐貍卵母細(xì)胞中卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，但沒有發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ[46]。相反，在培養(yǎng)液中添加牛生長(zhǎng)激素時(shí)卵丘細(xì)胞未發(fā)生擴(kuò)展，但發(fā)現(xiàn)有40%卵母細(xì)胞已完成核成熟。另外，N Songsasen等發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子（GH）能刺激犬卵母細(xì)胞中卵丘擴(kuò)展[11]，但不能提高卵母細(xì)胞成熟效率。不同研究出現(xiàn)不同效果可能與不同犬科動(dòng)物卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子反映不同有關(guān)。但有一篇文章報(bào)道隨卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度加大，成熟效率逐漸提高[12]。即Monica De los Reyes等在培養(yǎng)液中添加10 IU/mL hCG能顯著刺激（P＜0.05）犬COCs中卵丘擴(kuò)展，并且10 IU/mLhCG能提高COCs發(fā)育至MⅡ能力[12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)卵丘擴(kuò)展在COCs培養(yǎng)96 h后卵丘擴(kuò)展程度沒有繼續(xù)增強(qiáng)。

1.5 培養(yǎng)基、血清和能量

1.5.1 培養(yǎng)基

N Songsasen等研究無蛋白培養(yǎng)基中各種因子，能量對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用。發(fā)現(xiàn)犬卵母細(xì)胞在無蛋白培養(yǎng)基中能完成核成熟[11]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟效率有顯著差異（P＜0.05）。其中卵母細(xì)胞在TCM199培養(yǎng)基中成熟48 h有13%（6/121）發(fā)育至MⅡ，而在CMRL1066培養(yǎng)基中發(fā)育至MⅡ很低，在135枚卵母細(xì)胞中僅發(fā)現(xiàn)1枚發(fā)育至MII。

1.5.2 血清

Oh HJ等研究不同發(fā)情期犬血清對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟能力作用[48]。發(fā)現(xiàn)卵泡期卵母細(xì)胞在含10%發(fā)情期犬血清（14.2%）成熟液中體外成熟72 h，發(fā)育至MⅡ比例顯著高于（P＜0.05）其它組（5.2%；6.3%；FBS∶2.2%；2.2%）。同時(shí)10%發(fā)情期犬血清組（MⅡ∶13.5%）發(fā)育至MⅡ比例顯著（P＜0.05）高于其它濃度組（5%∶1.3%；20%∶5.1%；對(duì)照∶2.7%）。因此，成熟液中添加10%發(fā)情期犬血清對(duì)犬卵泡期卵母細(xì)胞體外成熟是必需的。本人研究發(fā)現(xiàn)，屠宰場(chǎng)和寵物醫(yī)院中獲取的卵巢多數(shù)處在非卵泡期。為珍惜卵巢資源，建議在上述研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究10%發(fā)情期犬血清對(duì)其它發(fā)情期卵巢中卵母細(xì)胞成熟效率影響。

1.5.3 能量

有報(bào)道表明，僅在培養(yǎng)液中添加葡萄糖作為能量，不能完全促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞核成熟能力。如Downs和Mastropolo報(bào)道小鼠卵母細(xì)胞在僅含葡萄糖為能源的培養(yǎng)基中能恢復(fù)減數(shù)分裂[49]，但僅有很小部分卵母細(xì)胞排出第1極體，而在培養(yǎng)液中添加0.23 mmol/L丙酮酸鹽能顯著提高卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力。上述研究結(jié)論可能對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟適用。已有研究嘗試在高氧（20%）條件下葡萄糖對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟作用。發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖（11.0 mmol/L）對(duì)犬卵母細(xì)胞核成熟有損害作用。但Hashimoto等發(fā)現(xiàn)在低氧濃度（5%）條件下，在含20 mmol/L葡萄糖成熟液中多數(shù)卵母細(xì)胞能發(fā)育至MⅡ[50]。因此，高濃度葡萄糖（11.0 mmol/L）可能促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟，但前提是卵母細(xì)胞在低氧條件下成熟，可能是由于低氧條件下能量消耗主要依賴于葡萄糖所致。因此，若要闡明能量對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用，還需從分子水平深入研究。

1.6 培養(yǎng)密度

T Otoi等研究培養(yǎng)密度對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟能力影響[10]，發(fā)現(xiàn)不同密度下卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力與供體所處生殖周期有關(guān)。發(fā)情后期卵巢中卵母細(xì)胞在一定體積（100μL）液滴中培養(yǎng)時(shí)，10枚/100μL組發(fā)育至MⅡ比例（16.2%）比例顯著（P＜0.05）高于5枚/100μL（4.6%）及其它組。在間情期組，10枚/100μL，15枚 /100μL發(fā)育至 MⅡ比例分別為10.4%和11.3%，而兩者間差異不顯著，但都高于其它組。表明培養(yǎng)液滴體積相同條件下，卵母細(xì)胞成熟能力與生殖周期有關(guān)。另外實(shí)驗(yàn)比較了相同培養(yǎng)密度和不同培養(yǎng)液滴體積條件下卵母細(xì)胞成熟能力大小。發(fā)現(xiàn)發(fā)情后期卵巢卵母細(xì)胞組中，10枚/100μL組發(fā)育至MⅡ比例（10.4%）高于1枚/10μL和5枚/50μL組，但都差異不顯著。而在間情期組中，各組發(fā)育至MⅡ比例皆在10%左右，差異不顯著。表明在培養(yǎng)密度相同條件下，培養(yǎng)液滴體積大小不影響發(fā)情后期和間情期卵巢卵母細(xì)胞體外成熟能力。所以，下步實(shí)驗(yàn)需要闡明培養(yǎng)液滴密度和體積是如何影響不同發(fā)情周期卵母細(xì)胞成熟能力。

1.7 溫度

截止目前，犬卵母細(xì)胞體外成熟多采用37℃[12，28]，38.5℃[12，30，51]和 39℃[25，52，53]。但無研究比較不同溫度下犬卵母細(xì)胞體外成熟能力大小。

僅有研究比較不同溫度下犬卵母細(xì)胞活性大小。H SLee等比較了4℃和38℃時(shí)卵母細(xì)胞活性[54]。發(fā)現(xiàn)保存（0 h），4℃與38℃活性差異不顯著（79.6%∶83.9%）。保存24 h，4℃下活性（13.2%）顯著小于38℃下的活性（77.8%）（P＜0.05）。保存 48 h后，4℃下卵母細(xì)胞活性為0，顯著（P＜0.05）小于 38℃（72.9%）。此研究表明，犬卵母細(xì)胞對(duì)溫度很敏感。而Bolamba等報(bào)道腔前卵泡中卵母細(xì)胞在4℃下保存，48h（36.4%）和 72h（44.4%）組間退化率差異不顯著[55]。上述不同研究結(jié)果可能與以下因素有關(guān)：（1）冷凍液體不同；（2）染色方法不同；（3）判斷標(biāo)準(zhǔn)不同。在別的物種中，如EcEvoy TG等認(rèn)為豬卵母細(xì)胞對(duì)低溫敏感，主要是由于豬卵母細(xì)胞中含有高濃度脂肪滴及與所含有的細(xì)胞膜成分[56]。他們發(fā)現(xiàn)卵丘包裹的GV期卵母細(xì)胞在低于等于15℃下不能存活[57]。犬卵母細(xì)胞中亦含有高濃度脂肪滴，在低溫條件下，犬卵母細(xì)胞質(zhì)膜中由于脂質(zhì)損害而降低犬卵母細(xì)胞活性。

1.8 各種因子

1.8.1 減數(shù)分裂抑制因子

N Songsasen等研究發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂抑制劑roscovitine不能顯著抑制犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力[23]，其中25 μmol/L roscovitine處理24 h 60%卵母細(xì)胞（共56枚卵母細(xì)胞）處于生發(fā)泡期（GV期），與對(duì)照組（不添加roscovitine）比較差異不顯著。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)dbcAMP顯著（P＜0.05）抑制犬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)能力，并且呈劑量依賴式。其中犬卵母細(xì)胞在5 mmol/L，10 mmol/L dbcAMP中作用24 h，分別有65%（共51枚卵母細(xì)胞）和54%（共63枚卵母細(xì)胞）卵母細(xì)胞處于生發(fā)泡期，顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組（不添加dbcAMP的23.8%）。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)dbcAMP處理24 h犬卵母細(xì)胞產(chǎn)生的抑制效應(yīng)是可逆的，犬卵母細(xì)胞在dbcAMP中處理24 h，然后在無dbcAMP中作用48 h，其發(fā)育至MⅡ比例與無dbcAMP組相同。此結(jié)論與小鼠及豬卵母細(xì)胞是一致的[58，59]。

1.8.2 生長(zhǎng)激素

Berenice de Avila Rodrigues等分別比較TCM199成熟液中添加1μg/mL雌二醇，20 μg/mL雌二醇和1μg/mL人生長(zhǎng)激素對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用，發(fā)現(xiàn)兩組間卵母細(xì)胞體外成熟72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例差異不顯著（14.1%∶10.2%）[26]。但實(shí)驗(yàn)沒有比較雌二醇和人生長(zhǎng)激素單獨(dú)作用對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟的作用。

1.8.3 β-巰基乙醇和EGF

β-巰基乙醇（β-ME）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）通過合成谷胱甘肽（GSH）保護(hù)卵母細(xì)胞和胚胎免受氧化反應(yīng)所致?lián)p害。已發(fā)現(xiàn)EGF能促進(jìn)人、牛、豬和嚙齒類動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟能力。KimMK等研究β-ME和EGF對(duì)不同發(fā)情期犬卵母細(xì)胞體外成熟作用[60]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加50 mmol/L或100 mmol/L β-ME能顯著促進(jìn)卵泡期卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力。與其它發(fā)情周期卵母細(xì)胞相比，25 mmol/L或100 mmol/Lβ-ME能顯著促進(jìn)卵泡期卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ能力。另外，與其它發(fā)情周期卵母細(xì)胞相比，20 ng/mLEGF能顯著促進(jìn)卵泡期卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ能力。因此，β-ME和EGF對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用依賴于發(fā)情周期。未來需要進(jìn)一步研究β-巰基乙醇和表皮生長(zhǎng)因子是如何促進(jìn)卵泡期卵母細(xì)胞發(fā)育能力，為優(yōu)化犬卵母細(xì)胞體外成熟體系作參考。

1.9 體內(nèi)來源卵母細(xì)胞

SYamada等對(duì)比格犬進(jìn)行超數(shù)排卵[2]，發(fā)現(xiàn)從卵巢中抽吸獲取的卵母細(xì)胞都處于生發(fā)泡期（GV）。當(dāng)卵母細(xì)胞體外成熟24 h，9.1%卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ。當(dāng)體外成熟48 h，卵丘細(xì)胞開始擴(kuò)展，27.3%發(fā)育至MⅡ。而培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，高達(dá)31.9%卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅡ，并且卵丘細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)展。此研究表明，體內(nèi)來源的卵母細(xì)胞核成熟能力與卵丘細(xì)胞擴(kuò)展成正比。但作者沒有報(bào)道卵母細(xì)胞體外發(fā)育72 h的發(fā)育能力。建議在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上延長(zhǎng)體外成熟時(shí)間，檢測(cè)卵母細(xì)胞最大發(fā)育潛能。另外，需要比較相同培養(yǎng)條件下體內(nèi)和體外卵母細(xì)胞成熟能力大小。

2 新培養(yǎng)方法

為了模擬犬卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過程，有較多研究采用細(xì)胞共培養(yǎng)（包括胚胎成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞），輸卵管液共培養(yǎng)及結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)以期望進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞體外成熟效率。

2.1 細(xì)胞共培養(yǎng)

2.1.1 胚胎成纖維細(xì)胞

S Hatoya等研究了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）和犬胚胎成纖維細(xì)胞（CEF）對(duì)犬卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）和體外胚胎發(fā)育（IVC）的影響。發(fā)現(xiàn)CEF能促進(jìn)犬卵母細(xì)胞體外發(fā)育至16-細(xì)胞，MEF能促進(jìn)犬卵母細(xì)胞發(fā)育至桑椹胚[51]。表明胚胎成纖維細(xì)胞（MEF，CEF）能夠促進(jìn)犬卵母細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟。

2.1.2 顆粒細(xì)胞和犬腎細(xì)胞

MPtaszynska研究了牛顆粒細(xì)胞和犬腎細(xì)胞對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟的作用，結(jié)果表明牛顆粒細(xì)胞和犬腎細(xì)胞都能促進(jìn)犬卵母細(xì)胞體外成熟。

2.1.3 輸卵管上皮細(xì)胞

Camila Infantosi Vannucchi等研究犬輸卵管上皮細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞核成熟作用[53]。在成熟液添加20 μg/mL雌二醇時(shí)，卵母細(xì)胞成熟96 h僅有5.2%發(fā)育至MⅡ，其它組更少比例發(fā)育至MⅡ期，此培養(yǎng)體系需要優(yōu)化。另外發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加孕酮能降低卵母細(xì)胞退化率（孕酮組：17.1%～25%；無孕酮組：42.3%～76.7%）。此實(shí)驗(yàn)所取樣本量少，如每組實(shí)驗(yàn)所取卵母細(xì)胞24～67枚，此結(jié)論需進(jìn)一步證實(shí)。

2.1.4 人工合成輸卵管液（SOF）

D A Hewitt研究人工合成輸卵管液（SOF）對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用[61]。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中添加SOF，卵母細(xì)胞成熟48 h并不能促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)（GVBD）（SOF+0.3%BSA組:45%；SOF+4%BSA組:36%；medium 199組:27%）和核成熟（MⅠ/AⅠ/MⅡ，SOF+0.3%BSA組:5%；SOF+4%BSA組:7%；對(duì)照199組:6%）。同時(shí)，在SOF液中添加低濃度牛血清白蛋白（0.3%BSA）不能促進(jìn)核成熟，而在SOF液中添加高濃度牛血清白蛋白（4%BSA）能促進(jìn)核成熟。此原因需要進(jìn)一步研究。在SOF液中添加低濃度牛血清白蛋白（0.3%BSA組:27%），卵母細(xì)胞體外成熟96 h核成熟能力受抑制，而對(duì)照組（63%）或SOF液添加高濃度BSA組（4%BSA組:62%）能促進(jìn)核成熟能力。牛血清白蛋白對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟的作用可能與SOF成分有關(guān)。

2.2 結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)

為了模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟發(fā)生在輸卵管的過程。Luvoni G C等研究分離出的輸卵管共培養(yǎng)對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟作用[62]。發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞與結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)時(shí)，有12.5%～31.9%的卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ。當(dāng)卵母細(xì)胞與結(jié)扎輸卵管共培養(yǎng)30 h，有63.8%卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，顯著高于（P＜0.001）液滴培養(yǎng)組（20.4%）及開放輸卵管組（27.1%）。隨體外成熟時(shí)間延長(zhǎng)，減數(shù)分裂恢復(fù)比例降低，體外成熟24 h（69.2%）和30 h（59.1%）減數(shù)分裂恢復(fù)比例顯著高于48 h（35.8%）。另外，卵母細(xì)胞在輸卵管中共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48h，卵母細(xì)胞退化比例（退化率：59.3%）顯著高于體外培養(yǎng)24 h組（18.7%）和30 h組（27.3%）。較高的退化率原因不清楚。若通過降低退化率有可能進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞發(fā)育至MII能力。

2.3 二維培養(yǎng)方法

Fulton R等在1998年從犬卵巢組織中分離出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。培養(yǎng)前在培養(yǎng)皿底鋪滿膠原，把卵泡放置在含TCM199成熟液中培養(yǎng)72 h，發(fā)現(xiàn)有較多比例卵母細(xì)胞（82/213，38.5%）發(fā)育至MⅡ[63]。表明犬卵泡中卵母細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中成熟能力較大。

2.4 卵泡培養(yǎng)方法

目前僅有一篇文章研究卵泡包被的卵母細(xì)胞放置于微滴中進(jìn)行培養(yǎng)中[64]。他們首先在體外分離出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。發(fā)現(xiàn)體外分離出的卵泡中卵母細(xì)胞有少數(shù)已發(fā)育至MⅠ/MⅡ（APAN：0.9% ；EAN:0.9%），表明卵母細(xì)胞在卵巢中可以恢復(fù)減數(shù)分裂。為了保持卵泡三維結(jié)構(gòu)，防止顆粒細(xì)胞損失，在培養(yǎng)皿底部鋪滿瓊脂。發(fā)現(xiàn)卵泡包被的卵母細(xì)胞在此條件下體外成熟24 h，APAN（5.3%，20/374）中卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例顯著高于（P＜0.05）體外成熟 0 h組（0.9%，3/318），體外成熟 48 h發(fā)育至 MⅠ/MⅡ比例增大（P＜0.05）（11.5%，47/407），但成熟至72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ沒有繼續(xù)增加（9.9%，40/404）。而EAN體外成熟24 h卵母細(xì)胞發(fā)育至MⅠ/MⅡ比例增加不顯著，而成熟至 48 h增加顯著（8.7%，11/126）（P＜0.05），成熟至 72 h發(fā)育至MⅠ/MⅡ增加亦不顯著（7.5%，8/106）。表明卵泡包被的卵母細(xì)胞（APAN，EAN）在培養(yǎng)起初階段，核成熟能力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，核成熟能力沒有顯著提高。

3 國內(nèi)研究進(jìn)展

目前，國內(nèi)有關(guān)犬卵母細(xì)胞體外成熟研究不多[65，66]，成熟效率不高。潘和平研究培養(yǎng)溫度對(duì)蘭州土狗卵母細(xì)胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn)37.0℃對(duì)COCs卵丘細(xì)胞擴(kuò)展作用明顯高于36.5℃，但此研究沒有觀察卵母細(xì)胞核相，其結(jié)論需進(jìn)一步證實(shí)。葉華虎采集發(fā)情期和間情期犬卵巢中卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)發(fā)情期大于2 mm和1～2 mm腔前卵泡中卵母細(xì)胞體外成熟效率（MⅠ/AⅠ/MⅡ：42.5%，32.5%）顯著高于間情期卵巢中卵母細(xì)胞（20.4%），并且卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟存在相關(guān)性。另外發(fā)現(xiàn)發(fā)情期犬血清能誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)展，但不能有效提高卵母細(xì)胞成熟效率。因此，需要更深入研究犬卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)理，以提高體外成熟效率。

4 展望

鑒于目前仍沒有找出優(yōu)良的體外成熟體系，需要在前人研究基礎(chǔ)上，采用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和新穎的實(shí)驗(yàn)思路，以優(yōu)化體外成熟體系。如采用分子生物學(xué)方法，基因芯片原理和技術(shù)，二維蛋白電泳技術(shù)研究犬卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)理。

5 致謝

感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張坤博士對(duì)本論文寫作方面的幫助和建議。

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S829.2

B

1005-2739（2010）01-0001-08

2009-09-23

王倫學(xué)，男，博士，助理研究員。