化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展*

魏光偉,余永鵬,魏文康,羅勝軍*

(1.廣東省前沿動(dòng)物保健有限公司,廣東廣州510550;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣東廣州510640)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)誕生于1977年,Halman M等[1]根據(jù)放射免疫分析的基本原理,將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來,發(fā)展出化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法。

CLIA與放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)、熒光免疫分析(fluorescence immunoassay,IFA)及酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunoassay,ELIA)相比,CLIA具有無輻射、標(biāo)記物有效期長及可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),已得到廣泛的應(yīng)用。CLIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、操作簡便、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備等特點(diǎn),應(yīng)用范圍較廣,既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體,又可用于核酸探針的檢測[2-3]。CLIA正被越來越多地用于蛋白質(zhì)、激素、腫瘤、病原微生物、毒物等成分的檢測,CLIA技術(shù)為獸醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)及食品分析檢測診斷和科學(xué)研究提供了一種痕量或超痕量的非同位素免疫檢測手段。

1 化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上,經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原-抗體復(fù)合物。然后進(jìn)行對標(biāo)記物進(jìn)行檢測,來測定待檢物[2]?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí),同時(shí)發(fā)射出光子,利用發(fā)光信號測量儀器光量子產(chǎn)率。

1.1 免疫分析原理

免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法,根據(jù)其檢測方法可分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析是利用抗原與抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后,其理化性質(zhì)發(fā)生改變,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測待檢物。標(biāo)記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上,然后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物,再對標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行檢測,從而間接檢測待檢物的方法[3]。目前常用的標(biāo)記物有放射性的125I,非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶,鑭系稀土元素等。

1.2 化學(xué)發(fā)光原理

化學(xué)發(fā)光是化學(xué)物質(zhì)在特定化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學(xué)反應(yīng)中激發(fā)單態(tài)分子的形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)過程:激發(fā)和發(fā)光過程。一個(gè)典型的化學(xué)發(fā)光過程包括三個(gè)基本過程:①化學(xué)反應(yīng)釋放足夠的能量,此過程存在產(chǎn)能效率φc;②發(fā)光物質(zhì)接收能量,發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變,形成激發(fā)態(tài)中間體,要求發(fā)光物質(zhì)接收能量的效率比較高(能量傳遞效率:φe);③激發(fā)態(tài)中間體通過光的形式釋放多余的能量回到基態(tài)[4]。激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的方式很多,如磷光,放熱等,所以激發(fā)態(tài)中間體的熒光效率φf也需要比較高。整個(gè)過程的化學(xué)發(fā)光效率φcL=φc×φe×φf。

1.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑標(biāo)記抗原或抗體,標(biāo)記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟,最后以測定發(fā)光強(qiáng)度形式測定待測物的含量。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類

化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)應(yīng)用發(fā)光體系應(yīng)用于免疫分析中的方式不同可分為直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析,酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

2.1 直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析

目前常見的標(biāo)記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。

2.1.1 魯米諾類標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析 Albrechtn闡述了合成分子魯米諾(luminuo)的化學(xué)發(fā)光[5]。魯米諾、異魯米諾(lsolumino1)及其衍生物是最早在CLIA中使用的一種常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。

魯米諾類物質(zhì)的發(fā)光為氧化反應(yīng)發(fā)光。在堿性溶液中,魯米諾可被許多氧化劑氧化而發(fā)光,其中H 2O2最為常用。但由于魯米諾氧化發(fā)光的反應(yīng)速度較慢,需添加某些酶類或無機(jī)催化劑。酶類主要使用辣根過氧化物酶(H RP),無機(jī)類包括O3、鹵素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它們的配合物。

早期的魯米諾體系主要用于無機(jī)物、有機(jī)生物小分子的測定,但由于標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使其靈敏度受到影響。20世紀(jì)80年代,人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物、胺類及衍生物及苯基硼酸衍生物對該體系的發(fā)光有顯著作用,在這些稱作增強(qiáng)劑的物質(zhì)作用下,魯米諾的發(fā)光強(qiáng)度可被提高1 000倍,并且氧化劑與發(fā)光劑等單獨(dú)作用時(shí)出現(xiàn)的“本底”發(fā)光顯著降低,發(fā)光時(shí)間也得到延長。這些增強(qiáng)劑的使用使得該體系在蛋白、核酸分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

2.1.2 吖啶酯類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析 Simpson報(bào)道了吖啶酯用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的初步研究。Weeks首次合成了用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的吖啶酯AE°NHS。由于AE°NHS的熱穩(wěn)定性不是很好,此后人們又相繼研究合成了較AE°NHS更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物并應(yīng)用于CLIA,其中Law S J等合成的吖啶酯DM AE°NHS被證明具有良好的熱穩(wěn)定性和發(fā)光性能,Ciba Coming公司的Magic Lite CLIA系列試劑盒,就是采用DMAE°NHS作為發(fā)光標(biāo)記物。

吖啶酯這類化合物只要在H2O2和OH-存在下就能迅速產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,且有很高的量子產(chǎn)率,如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達(dá)0.05,吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析,發(fā)光體系簡單、快速、不需要加入催化劑,且標(biāo)記效率高、本底低[6]。這些特點(diǎn)引起廣大分析診斷工作者的極大興趣。

目前,應(yīng)用于免疫分析標(biāo)記的標(biāo)記物主要為吖啶酯和吖啶-9-(N-磺?；?碳酰胺。近十年來,使用吖啶酯作為標(biāo)記物發(fā)展了各種不同分析物的競爭式和非競爭式免疫分析方法。美國拜耳公司診斷產(chǎn)品ACS∶180系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)即以吖啶酯作為標(biāo)記,量度AE標(biāo)記物化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所產(chǎn)生的光量子數(shù)作為基礎(chǔ),靈敏度可達(dá)10-15g/mL。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析

從標(biāo)記免疫分析角度,化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),應(yīng)屬酶免疫分析,只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同:以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(A LP),它們有各自的發(fā)光底物。

HRP有許多發(fā)光底物,但最常用的發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中,使用過氧化物酶標(biāo)記抗體,進(jìn)行免疫反應(yīng)后,利用魯米諾作為發(fā)光底物,在過氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH和H2 O2)作用下,魯米諾發(fā)光,酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度[7]。Amersham公司Am erliteTM發(fā)光酶免分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計(jì)的。但由于此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(H RP-H2O2-luminol)為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光、發(fā)光強(qiáng)度低、不易測量等缺點(diǎn)。后來,在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑,如螢火蟲熒光素,含有取代基的酚類化合物[如4-(3-噻吩基)酚類化合物]、萘酚、取代的溴酸化合物、乙酰苯胺類化合物等,以增強(qiáng)發(fā)光信號,并在較長的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,便于重復(fù)測量,從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。

堿性磷酸酶(A LP)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性好、活性高、易分離提純,已廣泛用于酶聯(lián)免疫分析和核酸雜交分析。堿性磷酸酶和1,2-二氧環(huán)乙烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的一類化學(xué)發(fā)光體系[8]。這類體系中具有代表性的是Bronstein等提出的ALP-AMPPD發(fā)光體系。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定,非酶催化的水解非常慢,在pH 12、0.05 mol/L碳酸鈉緩沖溶液中,分解半衰期可達(dá)74年,幾乎沒有試劑本身的發(fā)光背景。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物,可用來檢測堿性磷酸酶或抗體、核酸探針及其他配基的結(jié)合物。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有非常高的靈敏度,無論是固相還是液相檢測,對標(biāo)記物A LP的檢測限達(dá)10 mol～21 mol,是最靈敏的免疫測定方法之一。對AMPPD加以改進(jìn),獲得具有更好反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和更高靈敏度的新一代產(chǎn)物CSPD和CDP-Star。這些體系已廣泛用于各種基因、病原體DNA的鑒定。在臨床診斷的商業(yè)化試劑中,原美國DPC公司的Immulite system和Bec-kman Coulter公司的ACCESSAutomated Immunoassay System都是采用Dioxetane/ALP/Enhance System。

2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過程[9]。ECL的反應(yīng)在電極表面進(jìn)行,發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)32+],用另一反應(yīng)物三丙胺(TPA)來激發(fā)光反應(yīng)。在陽極表面,這兩種物質(zhì)可同時(shí)失去電子,發(fā)生氧化反應(yīng)。在電極板上二價(jià)的Ru(byp)32+迅速被氧化成三價(jià)Ru(byp)33+,與此同時(shí)TPA也在電極板上被氧化成陽離子自由基(TPA+°),TPA+°自發(fā)地釋放一個(gè)質(zhì)子而變成非穩(wěn)定分子(TPA°),將一個(gè)電子遞給Ru(byp)33+,形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)32+°。Ru(byp)32+°在衰減的同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長為620nm的光子,重新回到基態(tài)Ru(byp)32+。這一過程在電極表面反復(fù)進(jìn)行,產(chǎn)生高效、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光,并不斷增強(qiáng)[10]。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemilum inescence immunoassay)的突出優(yōu)點(diǎn)是:①標(biāo)記分子小,可實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記,標(biāo)記物非常穩(wěn)定。②發(fā)光時(shí)間長,靈敏度高,例如據(jù)LoranelleL報(bào)道,用均相電化學(xué)發(fā)光免疫分析促甲狀腺激素(TSH),檢測限為0.04 m IU/L。③光信號線性好,動(dòng)力學(xué)范圍寬,超過6個(gè)數(shù)量級。④可重復(fù)測量,重現(xiàn)性好。⑤可實(shí)現(xiàn)多元檢測。⑥可實(shí)現(xiàn)均相免疫分析。⑦快速,完成一個(gè)樣品的分析通常只需18 m in。⑧可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。由于電化學(xué)發(fā)光免疫分析具有優(yōu)越性,是一種很有發(fā)展前途的免疫分析法,日益受到人們的重視。目前已廣泛應(yīng)用于抗原、半抗原及抗體的免疫檢測。瑞士羅氏診斷試劑公司與德國Boehringer Mannheim(BM)公司攜手合作的Elecsys免疫分析系列商品藥盒也是采用釕聯(lián)吡啶/TPA電化學(xué)發(fā)光體系。該系統(tǒng)將ECL與鏈霉親和素包被磁珠的微粒子技術(shù)以及鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)結(jié)合起來,形成一種均相免疫分析,檢測靈敏度＜1 pmol/mL,線性范圍很寬,例如檢測促甲狀腺激素的靈敏度＜0.005μIU/mL,測定范圍高至100μIU/mL。

3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用

CLIA不需要外來光源,具有比IFA更高的信噪比,最低可以檢測到100個(gè)分子,其靈敏度比RIA或EIA高1至2個(gè)數(shù)量級,檢測范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級,自動(dòng)化程度高,提高了分析方法的精密度。CLIA已經(jīng)成為一種先進(jìn)的痕量或超痕量物質(zhì)檢測技術(shù)。

3.1 在獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

CLIA在獸醫(yī)檢測診斷研究和應(yīng)用還是處在初期階段,國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道很少。主要因?yàn)镃LIA是一項(xiàng)涉及化學(xué)、生物和獸醫(yī)等交叉學(xué)科知識的復(fù)雜性的研究,制約了CLIA在獸醫(yī)檢測診斷中研究和應(yīng)用的速度。

CLEIA已經(jīng)被歐盟列為檢測牛海綿樣腦病(BSE)的快速檢測手段之一,歐盟當(dāng)局也準(zhǔn)備把CLEIA推廣為小型反芻動(dòng)物如綿羊癢病(TSE)等此類疾病的快速檢測手段。

Buschm ann A等[11]用BSE的4種快速檢測方法(CLEIA、間接ELISA、夾心ELISA和Eestern blot)檢測了來自德國的48只綿羊及來自法國的209只綿羊和19只山羊,這些病例都經(jīng)過確診試驗(yàn)驗(yàn)證的。CLEIA檢測結(jié)果與確診試驗(yàn)非常吻合,而其它3種方法有53只綿羊與確診試驗(yàn)的結(jié)果不符。

G reening G E等用RT-PCR和CLEIA進(jìn)行了腸道RNA病毒檢測試驗(yàn)。他們在RT-PCR過程中加入DIG-dUTP(地高辛標(biāo)記的脫氧尿苷),把RTPCR產(chǎn)物和生物素標(biāo)記的腸道病毒特異核酸探針加到用抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板上,然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體,最后用ELISA和CLEIA進(jìn)行檢測。Greening G E發(fā)現(xiàn)CLEIA對脊髓灰質(zhì)炎病毒等腸道病毒具有非常高的靈敏度和特異性,他們認(rèn)為CLEIA應(yīng)該被用于環(huán)境水樣中腸道病毒的監(jiān)測。

Vidziunaite R等研究建立關(guān)于布魯菌病和野兔熱的增強(qiáng)型CLIA方法。經(jīng)研究他們確定CLIA檢測體系的最佳條件:包被抗體的濃度為20μg/mL,配對抗體濃度為200μg/mL。布魯菌和兔熱病檢測線性范圍分別為10 ng/mL～2 500 ng/mL和1 ng/mL～500 ng/mL。

Zamora BM等[12]用CLIA檢測來自德國不同實(shí)驗(yàn)室的屠宰豬肉樣品中沙門菌,用間接ELISA作為對比方法。檢測了超過1 350份樣品,CLIA的敏感性和特異性分別為97.3%和95.1%,而間接ELISA的敏感性和特異性分別為96.2%和94.6%。但是用間接ELISA檢測脂多糖抗原時(shí),與大腸埃希菌和耶爾森菌存在交叉反應(yīng),而這種交叉在用CLIA檢測時(shí)不存在。Zamora B M認(rèn)為主要是因?yàn)镃LIA具有更寬的檢測光譜,而獲得關(guān)于免疫反應(yīng)更特異性定義的能力。從整體數(shù)據(jù)上看CLIA與間接ELISA具有較高的相關(guān)性。基于研究的結(jié)果,Zamora BM認(rèn)為CLIA可作為屠宰豬肉中沙門菌抗體檢測的參考方法。Zamora BM等也用間接ELISA和CLIA檢測雞場中腸炎沙門菌,以建立一個(gè)監(jiān)測雞場中腸炎沙門菌感染的一個(gè)血清學(xué)檢測體系。研究認(rèn)為,間接ELISA和CLIA可用于監(jiān)測沒有免疫過腸炎沙門菌的雞群的腸炎沙門菌的感染。

Singh A K用ELISA和液相CLEIA檢測采集的豬和貓的血清樣本中弓形蟲的IgG(Toxop lasma IgG,T-IgG)。液相CLEIA對來自豬和貓的臨床樣品和加料樣本都可以靈敏地檢測出樣本中的TIgG,而ELISA對貓的臨床樣本中T-IgG不能靈敏地檢測出。

Falkenberg U等[13]用化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法檢測圍產(chǎn)期的經(jīng)產(chǎn)奶牛的不同的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的濃度,來評價(jià)其與繁殖性能的關(guān)系。研究選用了417頭黑白花奶牛。血清樣品分別在圍產(chǎn)期0、4、10、20、40 d采集。IGF-1的濃度范圍為圍產(chǎn)期12 h的57 ng/mL±18.9 ng/mL到圍產(chǎn)期40 d的74 ng/mL±19.9 ng/mL。研究發(fā)現(xiàn),IGF-1的檢測結(jié)果和奶牛懷孕的天數(shù)顯著相關(guān),同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)血清IGR-1濃度與奶牛的奶產(chǎn)量也成顯著相關(guān)。由此研究者認(rèn)為,利用化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)檢測圍產(chǎn)期奶牛的血清IGF-1濃度可以很好的預(yù)測奶牛場個(gè)體奶牛的繁殖性能。

Hu D等[14]報(bào)道一種檢測豬胸膜炎肺炎放線桿菌的ApxⅣ抗體的AuC l(4)-增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA)。A uCl(4)-是金顆粒標(biāo)記的兔抗豬抗體的不溶性產(chǎn)物,作為測定ApxⅣ抗體的化學(xué)發(fā)光分析的分析物。5.0×10-2mol的HCl、1.5×10-2mol的NaCl和2.5×10-4mol的Br2時(shí)金的溶出度最高。通過臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn),ApxⅣ抗體的CLIA與ELISA和IHA相比具有更高的靈敏度,更好的穩(wěn)定性和更好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,為檢測豬血清樣品中ApxⅣ抗體提供了一種新的檢測方法,可用于大規(guī)模樣品的篩選。

3.2 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

相對于獸醫(yī)領(lǐng)域來講,CLIA已廣泛應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,成為替代RIA的首選技術(shù)。

Amersham公司針對AmerliteT M發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)研制出的試劑盒項(xiàng)目有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。Amersham公司雖然研制出這10余種試劑盒,但因操作不夠簡便,檢測項(xiàng)目僅限于蛋白質(zhì)類大分子化合物,未能廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測。

美國Ciba Corning公司研制的ACS∶180自動(dòng)CLIA系統(tǒng)能非常精確測量閃光。經(jīng)過不斷的改進(jìn),實(shí)現(xiàn)了ACS∶180CLIA系統(tǒng)的全自動(dòng)化,推出全新產(chǎn)品“ADVIA系列”?，F(xiàn)有檢測項(xiàng)目47項(xiàng),主要有甲狀腺系統(tǒng):總及游離T3、總及游離T4、促甲狀腺素、超敏促甲狀腺素、T3攝取量;性腺系統(tǒng):絨毛膜促性腺激素、泌乳素、雌二醇、雌三醇、促卵泡素、促黃體素、孕酮、睪酮;血液系統(tǒng):維生素B12、葉酸、鐵蛋白;腫瘤標(biāo)記物:AFP、CEA、CA 15-3、CA 125、CA 19-9、β2微球蛋白、PSA;心血管系統(tǒng):肌紅蛋白、肌鈣蛋白T、肌酸激酶-MB;血藥濃度:地高辛、苯巴比妥、茶堿、萬古霉素、慶大霉素、洋地黃、馬可西平;其他:免疫球蛋白E、血清皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、尿游離脫氧吡啶。

Thorpe等報(bào)道,金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下可發(fā)出高強(qiáng)度的輝光,光信號可持續(xù)1 h～2 h。隨后國外生產(chǎn)廠家研制出以堿性磷酸酶為標(biāo)記物的試劑盒,與之相匹配的有DPC的IMMULITE全自動(dòng)CLIA系統(tǒng)和Beckman的ACCESS全自動(dòng)微粒子CLIA系統(tǒng)。IMMULITE全自動(dòng)CLIA系統(tǒng)可檢測項(xiàng)目有:心臟病檢測、甲狀腺功能檢測、性腺激素檢測、傳染病檢測、藥物檢測、血清學(xué)檢測、血液病檢測、成癮藥物檢測、糖尿病檢測、過敏檢測和腫瘤標(biāo)志物檢測。ACCESS全自動(dòng)微粒子CLIA系統(tǒng)可檢測項(xiàng)目主要有:甲狀腺功能:總及游離T3、總及游離T4、促甲狀腺素、超敏促甲狀腺素、T3攝取量;血液系統(tǒng):鐵蛋白、葉酸鹽、維生素B12;變態(tài)反應(yīng):總IgE;內(nèi)分泌激素:β-HCG、LH、FSH、E2、PT、PRL、皮質(zhì)醇(Cortisol);藥物檢測:茶堿、地高辛;腫瘤因子:CEA、AFP、PSA;心血管系統(tǒng)檢查:肌鈣蛋白I、肌紅蛋白;糖尿病檢查:胰島素。

目前商品化的ECL分析系統(tǒng)只有Roche公司的ECL全自動(dòng)分析系統(tǒng)。主要特點(diǎn)是本底信號極微,特異性更高,最小檢出值可小于1 pmol,操作十分簡便快速,是CLIA優(yōu)點(diǎn)較為集中的完美分析技術(shù)。

3.3 在食品分析上的應(yīng)用

Lin S等[15]建立CLEIA檢測雞肉中的氯霉素(CAP)的含量。檢測的極限是6 ng/mL。與ELISA相比,此CLEIA方法檢測雞肉中CAP的靈敏度是其10倍。當(dāng)雞肉中CAP的含量達(dá)到0.05μg/kg～5μg/kg時(shí),CLEIA檢測值得回歸為97%～118%,變異系數(shù)(CV%)為6%～22%。在做相關(guān)對比試驗(yàn)時(shí),CLEIA檢測結(jié)果與氣相色譜微孔板電子捕獲檢測結(jié)果相關(guān)性非常高。Zhang S等[16]認(rèn)為此方法非常適合雞肉樣品中CAP的篩查。

Liang P等報(bào)道采用ECL來對牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素以及β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了成功的檢測。Pang Y Q等[17]也采用ECL來進(jìn)行蜂產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素殘留的測定,方法是將三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)和三丙胺(TPA)維持在電壓1.05 V、pH 8.0的碳酸鹽緩沖液,用來檢測四環(huán)素和土霉素,檢測限分別為4.0 ng/mL和3.8 ng/mL,結(jié)果表明,這種方法的靈敏度高于所報(bào)道的絕大多數(shù)方法。

MagliuloM等[18]建立了一個(gè)用來檢測牛奶中的黃曲霉毒素M(1)的快速和超靈敏的CLEIA的分析方法。黃曲霉毒素M(1)標(biāo)準(zhǔn)的基質(zhì)是以牛奶為基礎(chǔ)而配制的緩沖液,牛奶樣品檢測時(shí)不需要任何處理。本方法定量的極限為1 ppt,批內(nèi)和批間的精密性非常好,變異系數(shù)(CV%)都小于9%,回收率的范圍為96%～122%。本方法具有非常高的特異性,與其他的黃曲霉毒素不存在明顯的交叉反應(yīng)。檢測了24份牛奶樣品,CLEIA與HPLC具有很好的相關(guān)性(y=0.98x+1.71,r2=0.98,n=24)Magliu lo M認(rèn)為與以前建立免疫分析方法比較,CLEIA非常用于大量牛奶樣品準(zhǔn)確靈敏的和高通量篩查黃曲霉毒素M(1),減少檢測的成本,提高檢測能力。

Rivera V R等[18]建立一個(gè)ECL分析方法,用于檢測人血清、未稀釋人尿和某些食品(全牛奶、蘋果汁、生牛肉、餡餅和生雞蛋)中的肉毒梭菌毒素A、B、E和F。不同類型的肉毒梭菌毒素的靈敏度,A和E型的靈敏度為50 pg/mL,B型的靈敏度為100 pg/mL,而F型為400 pg/mL。A型的最低檢測濃度為50 pg/mL,而B、E和F的最低濃度為50 pg/mL～100 pg/mL。本系統(tǒng)與其他類型的肉毒梭菌毒素不存在交叉反應(yīng)。本方法檢測極限與金標(biāo)準(zhǔn)小鼠生物監(jiān)測的水平相當(dāng),但是大大減少了測量時(shí)間。Rivera V R認(rèn)為此快速和靈敏的免疫分析方法在臨床醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和食品中的肉毒梭菌毒素篩查有非常廣的用途。

Yang M等[19]利用ECL(增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù))技術(shù)、納米碳管(CNT)和電荷耦合器件(CCD)開發(fā)出了一種新型的檢測食品中葡萄球菌腸毒素B(SEB)的化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)?？筍EB一抗被固定到CNT表面,抗體-納米管混合物被固定在聚碳酸酯表面,然后進(jìn)行ECL檢測,測出SEB的濃度。研究人員檢測了緩沖液、豆?jié){、蘋果汁和嬰兒食品等樣品,同時(shí)與熒光檢測法進(jìn)行了對比。結(jié)果表明,靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的ECL,達(dá)到了1 ng/mL。研究人員認(rèn)為此檢測方法具有簡單、通用性高和檢測成本較低的特點(diǎn)。

4 展望

目前,獸醫(yī)學(xué)診斷方法仍主要局限于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,難以適應(yīng)獸醫(yī)快速診斷的形勢。國外陸續(xù)報(bào)道了化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)及電化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等先進(jìn)技術(shù),這些方法都有更加廣泛的應(yīng)用前景,一旦方法成熟,它們的高靈敏度、高特異性將使獸醫(yī)檢測診斷的分析方法產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。

食品分析檢測的手段主要為毛細(xì)管氣相色譜和高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的食品測定需要使用昂貴的大型分析儀器,而且需要通過有機(jī)溶劑提取、凈化,前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力,無法進(jìn)行隨時(shí)隨地的快速檢測。本文報(bào)道的關(guān)于CLIA的一些檢測技術(shù),仍然處于摸索階段,其應(yīng)用及推廣仍有待于進(jìn)一步努力。

目前,化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用已非常成熟,有取代放射免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)成為診斷市場上的主流產(chǎn)品的趨勢。國外的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測系統(tǒng)價(jià)格昂貴,難以得到普及;國內(nèi)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測系統(tǒng)雖然價(jià)格較國外產(chǎn)品便宜很多,但是靈敏度和檢測的可靠性得不到保證。研究者在如何提高免疫診斷的敏感性和特異性、發(fā)展新的分析體系和檢測技術(shù)便攜化等方面仍需要不斷努力。

CLIA分析方法靈敏度高、特異性強(qiáng),方法多樣,廣泛地用于抗原、抗體和半抗原的免疫測定,其線性范圍也較寬,符合生物醫(yī)學(xué)和食品安全快速檢測的需要,為生物醫(yī)學(xué)和食品安全提供了一種超痕量的非同位素免疫檢測手段。隨著納米磁性粒子技術(shù)、新型免疫反應(yīng)增強(qiáng)劑和發(fā)光劑的研究開發(fā),流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫分析法(FI-CLIA)、毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CE-CLIA)、高效液相色譜化學(xué)發(fā)光免疫分析法(HPLC-CLIA)不斷開發(fā)和完善,CLIA在獸醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品分析等方面將會有更廣闊的應(yīng)用前景。

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