美國(guó)白蛾核型多角體病毒增殖方法

劉玉書(shū)，祁振坤，曹占明，孔凡濤，劉鯤鵬

（1.薊縣林業(yè)局，天津 薊縣 301900；2.薊縣國(guó)營(yíng)苗圃，天津 薊縣 301900）

美國(guó)白蛾核型多角體病毒，屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬Ⅰ型，是美國(guó)白蛾的天然病毒體，是美國(guó)白蛾的克星，為了獲得一定數(shù)量的病毒用于防治，2007～2009年我們?cè)趪?guó)營(yíng)青甸苗圃、小屯苗圃連續(xù)進(jìn)行了七次病毒增殖工作，摸索了一套簡(jiǎn)單有效的病毒增殖方法。

1 增殖病毒場(chǎng)地選擇及養(yǎng)蟲(chóng)臺(tái)的搭建

1.1 場(chǎng)地選擇

一是病毒增殖場(chǎng)地要選在交通方便地區(qū)；二是周?chē)谐渥愕奶烊换蛉斯ぴ灾驳闹参镲暳?；三是增殖室要求面積不低于100 m2，通風(fēng)透光，封閉性好，有照明設(shè)施；四是室內(nèi)或附近有水源，方便配制病毒藥液，便于進(jìn)行病毒增殖工作。

1.2 搭建病毒增殖平臺(tái)

在增殖室內(nèi)搭建幼蟲(chóng)養(yǎng)殖平臺(tái)進(jìn)行病毒增殖，可使單位面積使用效率倍增，有利于添加飼料，有利于幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育，便于感染病毒死蟲(chóng)的收集。

1.2.1 材料與工具

搭建平臺(tái)的材料有：竹竿（粗1.5～2 cm）、塑料布條、挷絲；工具有：剪刀、盒尺、鉗子、鋼鋸。

1.2.2 搭建平臺(tái)規(guī)格

病毒增殖平臺(tái)呈立體梯形。高100 cm，長(zhǎng)因地制宜而定，上寬80 cm、下寬85 cm。分上下兩層，下層距地面15 cm。增殖室內(nèi)可搭幾個(gè)平臺(tái)，平臺(tái)之間留寬1 m的工作道。

2 采集美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)

2.1 采蟲(chóng)工具及方法

剪枝手剪、高枝剪、裝蟲(chóng)袋子、扎口繩。根據(jù)養(yǎng)殖幼蟲(chóng)數(shù)量，確定采蟲(chóng)人員及工具。

2.2 采蟲(chóng)時(shí)期

用于病毒增殖的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)齡期應(yīng)在2～2.5齡為宜，偏早或偏晚都會(huì)影響病毒增殖工作的質(zhì)量，幼蟲(chóng)采集工作應(yīng)在1～2 d內(nèi)突擊完成。

2.3 采蟲(chóng)包裝及運(yùn)輸

采蟲(chóng)時(shí)隨采隨裝，剪掉粗1 cm以上的枝條并去掉無(wú)蟲(chóng)枝葉，自然裝滿為好，扎緊袋子口，存蔭涼處。運(yùn)輸時(shí)間盡可能縮短，到達(dá)病毒增殖場(chǎng)地立即將蟲(chóng)枝取出，以免采集的幼蟲(chóng)窒息死亡。

3 病毒接種

3.1 增殖室溫濕度要求

病毒增殖室溫度在25℃左右；相對(duì)濕度70%～85%最為適宜。如溫度低于10℃以下，蟲(chóng)體僵硬而死，核型多角體病毒含量低，此時(shí)應(yīng)采取增溫措施。

3.2 幼蟲(chóng)擺放密度

運(yùn)輸?shù)皆鲋车氐拿绹?guó)白蛾幼蟲(chóng)要及時(shí)擺放到增殖室平臺(tái)上，做到蟲(chóng)體分布均勻，合理密度為 3 500頭/m2。

3.3 病毒接種時(shí)期及濃度

按合理的密度擺放幼蟲(chóng)，立即向幼蟲(chóng)體及葉片上噴施病毒液 （接種病毒），使其盡快感染病毒，盡可能縮短病毒增殖的時(shí)間。幼蟲(chóng)接種病毒理想的濃度為美國(guó)白蛾核型多角體病毒1 000萬(wàn)個(gè)/ml。每天早晚兩次連噴3 d即可。

3.4 增殖用白蛾幼蟲(chóng)的喂養(yǎng)

增殖用美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)需注意添加食料，食料為新鮮的枝葉，一般需喂養(yǎng)15～18 d。根據(jù)蟲(chóng)口密度，決定喂食數(shù)量及次數(shù)。

4 致病死蟲(chóng)的收集與保存

接種病毒7 d后，個(gè)別齡期小的幼蟲(chóng)開(kāi)始死亡，這時(shí)要及時(shí)撿拾致病死蟲(chóng)，并收集保存。接種病毒10 d后，死蟲(chóng)開(kāi)始進(jìn)入高峰，自然致死蟲(chóng)內(nèi)核型多角體病毒含量高、質(zhì)量好，所以不死的幼蟲(chóng)暫不撿。幼蟲(chóng)接種病毒17 d后的活蟲(chóng)可全部收撿。致病死蟲(chóng)收集工作完成后，收集容器密封，于0～4℃下保存，待提取病毒。

5 清理增殖室

在白蛾病毒增殖過(guò)程中，要時(shí)刻保證增殖室在封閉狀態(tài)，防止白蛾幼蟲(chóng)逃逸，病毒增殖工作結(jié)束后，及時(shí)清理室內(nèi)枝葉，并銷(xiāo)毀。

6 病毒的提取與貯存

6.1 病毒液的提取

將低溫保存的蟲(chóng)尸在研磨破碎前3 d放入容器加適量無(wú)菌水，以淹沒(méi)蟲(chóng)尸為宜。用勻漿破碎機(jī)研磨粉碎，研磨時(shí)加入少量水，避免產(chǎn)生高溫。勻漿液用120目的紗網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次研磨，再用同樣紗網(wǎng)過(guò)濾，即成為美國(guó)白蛾多角體病毒液。

6.2 病毒液濃度的檢測(cè)

取混合均勻的病毒原液1 ml，稀釋1 000倍后，用血球計(jì)數(shù)板在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)在計(jì)數(shù)板一個(gè)視野里見(jiàn)到的病毒量太少（每視野低于5個(gè)），可再降低稀釋倍數(shù)；反之，提高稀釋倍數(shù)（每視野多于20個(gè)）。

病毒濃度=（80 小格內(nèi)數(shù)量÷80）×400×104×稀釋倍數(shù)

6.3 病毒懸液的保存

病毒懸液在密閉容器中0～4℃保存，在用于防治時(shí)按照施用濃度兌水配置即可。