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    銀杏內(nèi)酯B對癲癇模型大鼠腦保護(hù)作用及其機制研究

    2021-11-10 00:41:20魯光輝李新峰王海華
    江蘇中醫(yī)藥 2021年11期
    關(guān)鍵詞:空白對照海馬低劑量

    魯光輝 李新峰 馮 亮 羅 玲 王海華

    (邯鄲市第二醫(yī)院,河北邯鄲 056000)

    癲癇(epilepsy,EP)是一種較為常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,我國EP患者約900萬,每年新發(fā)病例約45萬,發(fā)病率為25~35個/10萬,并且具有反復(fù)性、自發(fā)性的特點,嚴(yán)重危害患者的身心健康[1]。EP發(fā)作是神經(jīng)元過度興奮和自由基堆積的過程,研究顯示EP發(fā)作時間超過30 min即可造成大腦神經(jīng)元損傷,海馬神經(jīng)元最為敏感[2],而氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在其病變過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor e2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是細(xì)胞調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號通路[5-6]。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B,GB)是從銀杏葉中提取出的一種倍半萜內(nèi)酯化合物,具有良好的抗氧化和抗凋亡活性[7],但GB能否通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡減輕EP所致腦組織損傷尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗通過制備EP大鼠模型,研究GB對EP模型大鼠氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及Nrf2/HO-1通路的影響,探討GB對EP模型大鼠腦保護(hù)作用及其機制,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 實驗材料

    1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠120只,體質(zhì)量220~250 g,由河北省實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(冀)2018-004],適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d后開展實驗。飼養(yǎng)條件:12 h光照黑暗交替,溫度(25±1)℃,相對濕度(65±5)%。本實驗通過邯鄲市第二醫(yī)院倫理委員會審查,倫理批號:HDEY LL〔K〕字2020-024。

    1.2 藥物與試劑 GB購自美國Sigma公司(批號:BN90418);注射用丙戊酸鈉(valproate,VPA)購自成都諾迪康生物制藥有限公司(批號:20190716);末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)染色試劑盒和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:200413、200326、200113、200308);兔抗鼠Nrf2、HO-1、核因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、激活型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:bs-1074R、bs-23667R、bs-20355R、bs-0081R、bsm-52289R、bs-0061R、bs-0295G)。

    1.3 主要儀器 石蠟包埋機(型號:TDK-BMB),孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)備公司;石蠟切片機(型號:RM2125),德國Leica公司;紫外-可見分光光度計(型號:UV2000),上海尤尼柯公司;電泳槽(型號:VE180)、轉(zhuǎn)膜儀(型號:VE186VE180),上海天能科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號:GelDoc2000),美國Bio-Rad公司;倒置光學(xué)顯微鏡(型號:AI09),日本奧林巴斯公司。

    2 實驗方法

    2.1 分組、造模與給藥 按照隨機數(shù)字表法將120只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、VPA組和GB低、中、高劑量組,每組20只。除空白對照組外,其余各組大鼠均參照康云霄等[8]報道的氯化鋰-匹羅卡品法誘導(dǎo)制備EP大鼠模型:以127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰溶液,20 h后以15 mg/kg劑量背部皮下注射匹羅卡品溶液。空白對照組上述步驟均同步給予生理鹽水。各組均在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射給予相應(yīng)劑量藥物或生理鹽水(空白對照組和模型組給予生理鹽水,GB低、中、高劑量組給藥劑量分別為2.5、5、10 mg/kg[9],VPA組給藥劑量為300 mg/kg[10])。

    2.2 大鼠行為學(xué)觀察 注射匹羅卡品后2 h內(nèi)觀察各組大鼠行為學(xué)變化,記錄EP首次發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間,參照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠EP發(fā)作程度進(jìn)行分級[11]:無發(fā)作為0級;須動及口周、面部肌肉抽搐為Ⅰ級;點頭或濕狗樣頻繁抖動為Ⅱ級;前肢局限性陣攣為Ⅲ級;前肢局限性陣攣伴后肢站立的全身強直性發(fā)作為Ⅳ級;伴有站立并摔倒、翻滾的全身強直陣攣發(fā)作為Ⅴ級。

    2.3 大腦海馬組織病理學(xué)檢查和神經(jīng)元凋亡觀察 注射匹羅卡品24 h后,各組隨機取10只大鼠,麻醉后開胸,暴露心臟,由左心室-右心耳通路依次灌注300 mL生理鹽水、300 mL 4%多聚甲醛溶液,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛溶液固定72 h后,行石蠟包埋、4 μm厚度切片、透明和脫蠟。部分組織切片行常規(guī)HE染色,中性樹脂封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬組織病理學(xué)改變。部分組織切片按照TUNEL試劑盒操作方法進(jìn)行處理,50%甘油封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況,細(xì)胞核黃褐色為陽性著色。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)計算:每只大鼠隨機取5張切片,計數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),取比值的百分比,AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

    2.4 大腦海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量檢測 注射匹羅卡品24 h后,取各組剩余的10只大鼠,麻醉后脊椎脫臼處死,斷頭取腦并剝離海馬,加入9倍量冷裂解液后研磨勻漿,4 ℃離心(離心半徑10 cm,3000 r/min,10 min)取上清液,然后采用黃嘌呤氧化法和鉬酸銨法分別檢測SOD、CAT活力,硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

    2.5 大腦海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)檢測 取“2.4”步驟海馬組織勻漿、離心所得的上清液,4 ℃離心(離心半徑10 cm,12 000 r/min,20 min)取沉淀,BCA法檢測總蛋白濃度,95 ℃水浴使蛋白變性后,SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,濕法轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后,滴加目標(biāo)蛋白(Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)和β-actin 一抗后4 ℃孵育過夜,PBS溶液洗膜后滴加IgG二抗37 ℃孵育1 h,洗膜后滴加DAB顯色,然后以β-actin為內(nèi)參半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 實驗結(jié)果

    3.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 空白對照組大鼠行為正常,未出現(xiàn)EP發(fā)作,EP發(fā)作級別為0級。模型組大鼠發(fā)作程度評級明顯高于模型組(P<0.01)。各給藥組與模型組組間各項指標(biāo)比較結(jié)果見表1。

    表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較(±s)

    表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 潛伏期/s 發(fā)作持續(xù)時間/min 發(fā)作程度/級空白對照組 10 0.00±0.00模型組 10 125.84±20.18 26.13±3.75 3.80±0.62**GB低劑量組 10 144.15±22.71 23.65±4.09 3.30±0.57 GB中劑量組 10 205.37±34.59△△▲▲ 14.83±2.94△△▲▲ 2.40±0.46△△▲▲GB高劑量組 10 327.64±45.27△△▲▲&& 7.05±1.48△△▲▲&& 1.20±0.25△△▲▲&&VPA組 10 281.92±43.07△△▲▲&&# 9.40±1.58△△▲▲&&## 1.50±0.37△△▲▲&&#

    3.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變比較 空白對照組大鼠海馬神經(jīng)元呈圓形或橢圓形,排列整齊、層次清晰,核膜、核仁清晰;模型組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)數(shù)量減少,形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂、層次不清,核仁固縮、偏移、深染等病理學(xué)改變;與模型組比較,GB各劑量組和VPA組大鼠海馬神經(jīng)元上述病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度減輕,其中GB高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少不明顯,形態(tài)較規(guī)則,排列較整齊,效果優(yōu)于其他組。見圖1。

    圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變情況(HE,×400)

    3.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡水平比較 空白對照組大鼠海馬區(qū)僅可見極少量凋亡神經(jīng)元,AI為(3.48±0.57)%;與空白對照組比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯增多,AI為(46.95±8.01)%,明顯高于空白對照組(P<0.01);與模型組比較,GB中、高劑量組和VPA組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少,AI分別為(24.01±4.73)%、(14.39±2.84)%、(17.74±3.08)%,均明顯低于模型組(P<0.01);GB低劑量組AI為(39.47±7.62)%,明顯高于GB中、高 劑 量 組 和VPA組(P<0.01);GB高 劑 量 組 和VPA組AI明 顯低于GB中劑量組(P<0.01);GB高劑量組AI明顯低于VPA組(P<0.05)。見圖2。

    圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL,×400)

    3.4 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較 與空白對照組比較,模型組大鼠海馬組織SOD、CAT活力降低,MDA含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組與模型組組間上述指標(biāo)比較結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較(±s)

    表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&P<0.05,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 SOD/(U/mg) CAT/(U/mg) MDA/(nmol/mg)空白對照組 10 2.71±0.30 54.86±6.59 7.23±1.41模型組 10 1.39±0.18** 44.92±4.70** 27.64±3.82**GB低劑量組 10 1.52±0.17 47.08±5.53 25.40±3.69 GB中劑量組 10 1.86±0.20△△▲▲ 49.52±5.74△ 19.82±3.18△△▲▲GB高劑量組 10 2.16±0.23△△▲▲&& 52.37±6.28△△ 13.54±2.71△△▲▲&&VPA組 10 1.80±0.19△△▲▲## 51.16±5.95△ 16.35±3.07△△▲▲&#D E F

    3.5 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較,模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1表達(dá)下調(diào),NF-κB、Cleaved Caspase-3表 達(dá) 上 調(diào),Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組上述指標(biāo)表達(dá)見圖3,各給藥組與模型組組間上述指標(biāo)比較結(jié)果見表3。

    表3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值比較(±s)

    表3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 Nrf2/β-actin HO-1/β-actin NF-κB/β-actin Caspase-3/β-actin Cleaved Caspase-3/β-actin Cleaved Caspase-3/Caspase-3空白對照組 10 0.96±0.15 0.88±0.16 0.04±0.02 0.67±0.11 0.03±0.01 0.05±0.02模型組 10 0.14±0.04** 0.07±0.02** 0.75±0.18** 0.62±0.13 0.97±0.18** 1.56±0.27**GB低劑量組 10 0.23±0.05△△ 0.09±0.03 0.61±0.14 0.69±0.14 0.63±0.15△△ 0.97±0.18△△GB中劑量組 10 0.35±0.07△△▲▲ 0.22±0.05△△▲▲ 0.24±0.05△△▲▲ 0.65±0.13 0.46±0.13△△▲ 0.71±0.16△△▲▲GB高劑量組 10 0.78±0.14△△▲▲&& 0.57±0.13△△▲▲&& 0.10±0.04△△▲▲&& 0.67±0.12 0.20±0.05△△▲▲&& 0.30±0.08△△▲▲&&VPA組 10 0.53±0.09△△▲▲&&## 0.42±0.11△△▲▲&&# 0.21±0.05△△▲▲## 0.67±0.13 0.27±0.07△△▲▲&&# 0.41±0.09△△▲▲&&##

    圖3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

    4 討論

    EP是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,長期反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響患者的身心健康。大部分患者經(jīng)藥物治療能夠有效控制EP發(fā)作,但仍有約30%的患者療效不佳而逐漸發(fā)展為難治性EP。EP發(fā)病機制尚未完全闡明,有研究證實氧化應(yīng)激反應(yīng)和繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡是EP發(fā)作和神經(jīng)退行性變的核心環(huán)節(jié)[3]。因此,尋找靶向抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的新型藥物或許是改善EP患者預(yù)后的有效途徑。

    GB是從中藥銀杏葉中提取出的一種小分子活性單體化合物,具有抗氧化、抗凋亡等藥理學(xué)作用,較易通過血腦屏障,WANG L等[7]研究發(fā)現(xiàn)GB能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡減輕大鼠缺血性腦損傷。VPA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的廣譜抗癲癇藥,也是新型抗癲癇藥研究動物實驗的常用陽性對照藥物。臨床上以顳葉癲癇最為常見,EP實驗動物模型的制備方法主要有電點燃和化學(xué)點燃兩大類,其中氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點燃法制備的EP大鼠模型為顳葉癲癇,與人類EP病理特點一致,并且操作簡便、重復(fù)性高,是最公認(rèn)的EP大鼠模型制作方法[12]。本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)制備EP大鼠模型,以VPA作為陽性對照藥物,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯延長EP大鼠EP發(fā)作潛伏期,縮短發(fā)作持續(xù)時間,降低EP發(fā)作程度,明顯改善EP大鼠海馬神經(jīng)元病變,抑制海馬神經(jīng)元凋亡,GB低、中、高劑量對EP發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間、發(fā)作程度及海馬神經(jīng)元凋亡的影響具有劑量依賴性,且GB高劑量上述效應(yīng)優(yōu)于VPA,提示GB對EP大鼠具有抗癇和腦組織保護(hù)作用。

    活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)代謝失衡是導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激損傷的基礎(chǔ)。EP發(fā)作時神經(jīng)元過度興奮和異常放電導(dǎo)致ROS大量生成與釋放[13]。以ROS為底物的抗氧化酶(SOD、CAT)被過度消耗致使ROS過剩,ROS攻擊破壞核酸、蛋白質(zhì)及生物膜脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),生成具有生物毒性的MDA,因此SOD、CAT活力和MDA含量能夠反映機體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度[14]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯提高EP大鼠海馬組織SOD、CAT活力并降低MDA含量,GB低、中、高劑量對SOD活力和MDA含量的調(diào)控作用具有劑量依賴性,且GB高劑量對SOD活力和MDA含量的調(diào)控作用優(yōu)于VPA,提示GB對EP大鼠氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

    Nrf2是一種對機體氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子。DESHMUKH P等[15]研究發(fā)現(xiàn),ROS能夠誘導(dǎo)Nrf2與抑制劑Keap1解離而活化,核轉(zhuǎn)位并激活抗氧化反應(yīng)元件,促進(jìn)抗氧化酶(SOD、CAT等)轉(zhuǎn) 錄 與 表 達(dá)。HO-1為Nrf2下游基因,Nrf2核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)而催化降解血紅素、一氧化碳等,從而抑制氧化應(yīng)激損傷[16-17]。細(xì)胞凋亡過程由多種基因參與調(diào)控,其 中Caspase-3被 剪 切 活 化(Cleved Caspase-3)后參與細(xì)胞凋亡的啟動與執(zhí)行全過程,被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的調(diào)控因子[18]。翟春梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)與活化,HO-1能 夠 抑 制NF-κB啟 動 子IKKβ磷 酸化進(jìn)而抑制NF-κB活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn),GB能夠明顯上調(diào)EP大鼠海馬組織Nrf2、HO-1表達(dá)并 下 調(diào)NF-κB、Cleaved Caspase-3表 達(dá),降 低Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值,GB低、中、高劑量對Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值的影響具有劑量依賴性,且GB高劑量組上述效應(yīng)優(yōu)于VPA組,提示GB對EP大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。

    綜上所述,GB對EP大鼠具有抗癇和腦組織保護(hù)作用,其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。下一步本課題組擬研究EP大鼠血腦屏障損傷機制及GB的干預(yù)作用,以進(jìn)一步揭示GB治療EP的藥理機制。

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