• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    銀杏內(nèi)酯B對癲癇模型大鼠腦保護(hù)作用及其機制研究

    2021-11-10 00:41:20魯光輝李新峰王海華
    江蘇中醫(yī)藥 2021年11期
    關(guān)鍵詞:空白對照海馬低劑量

    魯光輝 李新峰 馮 亮 羅 玲 王海華

    (邯鄲市第二醫(yī)院,河北邯鄲 056000)

    癲癇(epilepsy,EP)是一種較為常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,我國EP患者約900萬,每年新發(fā)病例約45萬,發(fā)病率為25~35個/10萬,并且具有反復(fù)性、自發(fā)性的特點,嚴(yán)重危害患者的身心健康[1]。EP發(fā)作是神經(jīng)元過度興奮和自由基堆積的過程,研究顯示EP發(fā)作時間超過30 min即可造成大腦神經(jīng)元損傷,海馬神經(jīng)元最為敏感[2],而氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在其病變過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor e2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是細(xì)胞調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號通路[5-6]。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B,GB)是從銀杏葉中提取出的一種倍半萜內(nèi)酯化合物,具有良好的抗氧化和抗凋亡活性[7],但GB能否通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡減輕EP所致腦組織損傷尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗通過制備EP大鼠模型,研究GB對EP模型大鼠氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及Nrf2/HO-1通路的影響,探討GB對EP模型大鼠腦保護(hù)作用及其機制,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 實驗材料

    1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠120只,體質(zhì)量220~250 g,由河北省實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(冀)2018-004],適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d后開展實驗。飼養(yǎng)條件:12 h光照黑暗交替,溫度(25±1)℃,相對濕度(65±5)%。本實驗通過邯鄲市第二醫(yī)院倫理委員會審查,倫理批號:HDEY LL〔K〕字2020-024。

    1.2 藥物與試劑 GB購自美國Sigma公司(批號:BN90418);注射用丙戊酸鈉(valproate,VPA)購自成都諾迪康生物制藥有限公司(批號:20190716);末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)染色試劑盒和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:200413、200326、200113、200308);兔抗鼠Nrf2、HO-1、核因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、激活型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:bs-1074R、bs-23667R、bs-20355R、bs-0081R、bsm-52289R、bs-0061R、bs-0295G)。

    1.3 主要儀器 石蠟包埋機(型號:TDK-BMB),孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)備公司;石蠟切片機(型號:RM2125),德國Leica公司;紫外-可見分光光度計(型號:UV2000),上海尤尼柯公司;電泳槽(型號:VE180)、轉(zhuǎn)膜儀(型號:VE186VE180),上海天能科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號:GelDoc2000),美國Bio-Rad公司;倒置光學(xué)顯微鏡(型號:AI09),日本奧林巴斯公司。

    2 實驗方法

    2.1 分組、造模與給藥 按照隨機數(shù)字表法將120只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、VPA組和GB低、中、高劑量組,每組20只。除空白對照組外,其余各組大鼠均參照康云霄等[8]報道的氯化鋰-匹羅卡品法誘導(dǎo)制備EP大鼠模型:以127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰溶液,20 h后以15 mg/kg劑量背部皮下注射匹羅卡品溶液。空白對照組上述步驟均同步給予生理鹽水。各組均在注射匹羅卡品前30 min腹腔注射給予相應(yīng)劑量藥物或生理鹽水(空白對照組和模型組給予生理鹽水,GB低、中、高劑量組給藥劑量分別為2.5、5、10 mg/kg[9],VPA組給藥劑量為300 mg/kg[10])。

    2.2 大鼠行為學(xué)觀察 注射匹羅卡品后2 h內(nèi)觀察各組大鼠行為學(xué)變化,記錄EP首次發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間,參照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠EP發(fā)作程度進(jìn)行分級[11]:無發(fā)作為0級;須動及口周、面部肌肉抽搐為Ⅰ級;點頭或濕狗樣頻繁抖動為Ⅱ級;前肢局限性陣攣為Ⅲ級;前肢局限性陣攣伴后肢站立的全身強直性發(fā)作為Ⅳ級;伴有站立并摔倒、翻滾的全身強直陣攣發(fā)作為Ⅴ級。

    2.3 大腦海馬組織病理學(xué)檢查和神經(jīng)元凋亡觀察 注射匹羅卡品24 h后,各組隨機取10只大鼠,麻醉后開胸,暴露心臟,由左心室-右心耳通路依次灌注300 mL生理鹽水、300 mL 4%多聚甲醛溶液,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛溶液固定72 h后,行石蠟包埋、4 μm厚度切片、透明和脫蠟。部分組織切片行常規(guī)HE染色,中性樹脂封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬組織病理學(xué)改變。部分組織切片按照TUNEL試劑盒操作方法進(jìn)行處理,50%甘油封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況,細(xì)胞核黃褐色為陽性著色。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)計算:每只大鼠隨機取5張切片,計數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),取比值的百分比,AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

    2.4 大腦海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量檢測 注射匹羅卡品24 h后,取各組剩余的10只大鼠,麻醉后脊椎脫臼處死,斷頭取腦并剝離海馬,加入9倍量冷裂解液后研磨勻漿,4 ℃離心(離心半徑10 cm,3000 r/min,10 min)取上清液,然后采用黃嘌呤氧化法和鉬酸銨法分別檢測SOD、CAT活力,硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

    2.5 大腦海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)檢測 取“2.4”步驟海馬組織勻漿、離心所得的上清液,4 ℃離心(離心半徑10 cm,12 000 r/min,20 min)取沉淀,BCA法檢測總蛋白濃度,95 ℃水浴使蛋白變性后,SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,濕法轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后,滴加目標(biāo)蛋白(Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)和β-actin 一抗后4 ℃孵育過夜,PBS溶液洗膜后滴加IgG二抗37 ℃孵育1 h,洗膜后滴加DAB顯色,然后以β-actin為內(nèi)參半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 實驗結(jié)果

    3.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 空白對照組大鼠行為正常,未出現(xiàn)EP發(fā)作,EP發(fā)作級別為0級。模型組大鼠發(fā)作程度評級明顯高于模型組(P<0.01)。各給藥組與模型組組間各項指標(biāo)比較結(jié)果見表1。

    表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較(±s)

    表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 潛伏期/s 發(fā)作持續(xù)時間/min 發(fā)作程度/級空白對照組 10 0.00±0.00模型組 10 125.84±20.18 26.13±3.75 3.80±0.62**GB低劑量組 10 144.15±22.71 23.65±4.09 3.30±0.57 GB中劑量組 10 205.37±34.59△△▲▲ 14.83±2.94△△▲▲ 2.40±0.46△△▲▲GB高劑量組 10 327.64±45.27△△▲▲&& 7.05±1.48△△▲▲&& 1.20±0.25△△▲▲&&VPA組 10 281.92±43.07△△▲▲&&# 9.40±1.58△△▲▲&&## 1.50±0.37△△▲▲&&#

    3.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變比較 空白對照組大鼠海馬神經(jīng)元呈圓形或橢圓形,排列整齊、層次清晰,核膜、核仁清晰;模型組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)數(shù)量減少,形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂、層次不清,核仁固縮、偏移、深染等病理學(xué)改變;與模型組比較,GB各劑量組和VPA組大鼠海馬神經(jīng)元上述病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度減輕,其中GB高劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少不明顯,形態(tài)較規(guī)則,排列較整齊,效果優(yōu)于其他組。見圖1。

    圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變情況(HE,×400)

    3.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡水平比較 空白對照組大鼠海馬區(qū)僅可見極少量凋亡神經(jīng)元,AI為(3.48±0.57)%;與空白對照組比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯增多,AI為(46.95±8.01)%,明顯高于空白對照組(P<0.01);與模型組比較,GB中、高劑量組和VPA組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少,AI分別為(24.01±4.73)%、(14.39±2.84)%、(17.74±3.08)%,均明顯低于模型組(P<0.01);GB低劑量組AI為(39.47±7.62)%,明顯高于GB中、高 劑 量 組 和VPA組(P<0.01);GB高 劑 量 組 和VPA組AI明 顯低于GB中劑量組(P<0.01);GB高劑量組AI明顯低于VPA組(P<0.05)。見圖2。

    圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL,×400)

    3.4 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較 與空白對照組比較,模型組大鼠海馬組織SOD、CAT活力降低,MDA含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組與模型組組間上述指標(biāo)比較結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較(±s)

    表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活力和MDA含量比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&P<0.05,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 SOD/(U/mg) CAT/(U/mg) MDA/(nmol/mg)空白對照組 10 2.71±0.30 54.86±6.59 7.23±1.41模型組 10 1.39±0.18** 44.92±4.70** 27.64±3.82**GB低劑量組 10 1.52±0.17 47.08±5.53 25.40±3.69 GB中劑量組 10 1.86±0.20△△▲▲ 49.52±5.74△ 19.82±3.18△△▲▲GB高劑量組 10 2.16±0.23△△▲▲&& 52.37±6.28△△ 13.54±2.71△△▲▲&&VPA組 10 1.80±0.19△△▲▲## 51.16±5.95△ 16.35±3.07△△▲▲&#D E F

    3.5 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較,模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1表達(dá)下調(diào),NF-κB、Cleaved Caspase-3表 達(dá) 上 調(diào),Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組上述指標(biāo)表達(dá)見圖3,各給藥組與模型組組間上述指標(biāo)比較結(jié)果見表3。

    表3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值比較(±s)

    表3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值比較(±s)

    注: 與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與GB低劑量組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與GB中劑量組比較,&&P<0.01;與GB高劑量組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別 動物數(shù)/只 Nrf2/β-actin HO-1/β-actin NF-κB/β-actin Caspase-3/β-actin Cleaved Caspase-3/β-actin Cleaved Caspase-3/Caspase-3空白對照組 10 0.96±0.15 0.88±0.16 0.04±0.02 0.67±0.11 0.03±0.01 0.05±0.02模型組 10 0.14±0.04** 0.07±0.02** 0.75±0.18** 0.62±0.13 0.97±0.18** 1.56±0.27**GB低劑量組 10 0.23±0.05△△ 0.09±0.03 0.61±0.14 0.69±0.14 0.63±0.15△△ 0.97±0.18△△GB中劑量組 10 0.35±0.07△△▲▲ 0.22±0.05△△▲▲ 0.24±0.05△△▲▲ 0.65±0.13 0.46±0.13△△▲ 0.71±0.16△△▲▲GB高劑量組 10 0.78±0.14△△▲▲&& 0.57±0.13△△▲▲&& 0.10±0.04△△▲▲&& 0.67±0.12 0.20±0.05△△▲▲&& 0.30±0.08△△▲▲&&VPA組 10 0.53±0.09△△▲▲&&## 0.42±0.11△△▲▲&&# 0.21±0.05△△▲▲## 0.67±0.13 0.27±0.07△△▲▲&&# 0.41±0.09△△▲▲&&##

    圖3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

    4 討論

    EP是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,長期反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響患者的身心健康。大部分患者經(jīng)藥物治療能夠有效控制EP發(fā)作,但仍有約30%的患者療效不佳而逐漸發(fā)展為難治性EP。EP發(fā)病機制尚未完全闡明,有研究證實氧化應(yīng)激反應(yīng)和繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡是EP發(fā)作和神經(jīng)退行性變的核心環(huán)節(jié)[3]。因此,尋找靶向抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的新型藥物或許是改善EP患者預(yù)后的有效途徑。

    GB是從中藥銀杏葉中提取出的一種小分子活性單體化合物,具有抗氧化、抗凋亡等藥理學(xué)作用,較易通過血腦屏障,WANG L等[7]研究發(fā)現(xiàn)GB能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡減輕大鼠缺血性腦損傷。VPA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的廣譜抗癲癇藥,也是新型抗癲癇藥研究動物實驗的常用陽性對照藥物。臨床上以顳葉癲癇最為常見,EP實驗動物模型的制備方法主要有電點燃和化學(xué)點燃兩大類,其中氯化鋰-匹羅卡品化學(xué)點燃法制備的EP大鼠模型為顳葉癲癇,與人類EP病理特點一致,并且操作簡便、重復(fù)性高,是最公認(rèn)的EP大鼠模型制作方法[12]。本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)制備EP大鼠模型,以VPA作為陽性對照藥物,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯延長EP大鼠EP發(fā)作潛伏期,縮短發(fā)作持續(xù)時間,降低EP發(fā)作程度,明顯改善EP大鼠海馬神經(jīng)元病變,抑制海馬神經(jīng)元凋亡,GB低、中、高劑量對EP發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間、發(fā)作程度及海馬神經(jīng)元凋亡的影響具有劑量依賴性,且GB高劑量上述效應(yīng)優(yōu)于VPA,提示GB對EP大鼠具有抗癇和腦組織保護(hù)作用。

    活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)代謝失衡是導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激損傷的基礎(chǔ)。EP發(fā)作時神經(jīng)元過度興奮和異常放電導(dǎo)致ROS大量生成與釋放[13]。以ROS為底物的抗氧化酶(SOD、CAT)被過度消耗致使ROS過剩,ROS攻擊破壞核酸、蛋白質(zhì)及生物膜脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),生成具有生物毒性的MDA,因此SOD、CAT活力和MDA含量能夠反映機體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度[14]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)GB干預(yù)能夠明顯提高EP大鼠海馬組織SOD、CAT活力并降低MDA含量,GB低、中、高劑量對SOD活力和MDA含量的調(diào)控作用具有劑量依賴性,且GB高劑量對SOD活力和MDA含量的調(diào)控作用優(yōu)于VPA,提示GB對EP大鼠氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

    Nrf2是一種對機體氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子。DESHMUKH P等[15]研究發(fā)現(xiàn),ROS能夠誘導(dǎo)Nrf2與抑制劑Keap1解離而活化,核轉(zhuǎn)位并激活抗氧化反應(yīng)元件,促進(jìn)抗氧化酶(SOD、CAT等)轉(zhuǎn) 錄 與 表 達(dá)。HO-1為Nrf2下游基因,Nrf2核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)而催化降解血紅素、一氧化碳等,從而抑制氧化應(yīng)激損傷[16-17]。細(xì)胞凋亡過程由多種基因參與調(diào)控,其 中Caspase-3被 剪 切 活 化(Cleved Caspase-3)后參與細(xì)胞凋亡的啟動與執(zhí)行全過程,被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的調(diào)控因子[18]。翟春梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)與活化,HO-1能 夠 抑 制NF-κB啟 動 子IKKβ磷 酸化進(jìn)而抑制NF-κB活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn),GB能夠明顯上調(diào)EP大鼠海馬組織Nrf2、HO-1表達(dá)并 下 調(diào)NF-κB、Cleaved Caspase-3表 達(dá),降 低Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值,GB低、中、高劑量對Nrf2、HO-1、NF-κB、Cleaved Caspase-3表達(dá)及Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值的影響具有劑量依賴性,且GB高劑量組上述效應(yīng)優(yōu)于VPA組,提示GB對EP大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。

    綜上所述,GB對EP大鼠具有抗癇和腦組織保護(hù)作用,其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。下一步本課題組擬研究EP大鼠血腦屏障損傷機制及GB的干預(yù)作用,以進(jìn)一步揭示GB治療EP的藥理機制。

    猜你喜歡
    空白對照海馬低劑量
    海馬
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學(xué)中的應(yīng)用
    海馬
    過表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    16排螺旋CT低劑量掃描技術(shù)在腹部中的應(yīng)用
    “海馬”自述
    自適應(yīng)統(tǒng)計迭代重建算法在頭部低劑量CT掃描中的應(yīng)用
    低劑量輻射致癌LNT模型研究進(jìn)展
    正常和慢心率CT冠狀動脈低劑量掃描對比研究
    欧美在线黄色| 在线观看午夜福利视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 成人一区二区视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费在线观看成人毛片| 成人精品一区二区免费| 久久久久久人人人人人| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99在线视频只有这里精品首页| 国产成人啪精品午夜网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲国产看品久久| 国产黄色小视频在线观看| 在线看三级毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 一区二区三区激情视频| 99热只有精品国产| tocl精华| 亚洲av成人精品一区久久| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热6这里只有精品| 99精品在免费线老司机午夜| 男人舔女人的私密视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 无人区码免费观看不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| www.自偷自拍.com| 99国产综合亚洲精品| 午夜激情欧美在线| 韩国av一区二区三区四区| 男人舔女人的私密视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费在线观看亚洲国产| 特级一级黄色大片| 中出人妻视频一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产精品成人综合色| 99久国产av精品| 日本熟妇午夜| 草草在线视频免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| e午夜精品久久久久久久| 成人精品一区二区免费| 精品久久久久久,| 久久中文字幕人妻熟女| 色综合欧美亚洲国产小说| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 青草久久国产| 看片在线看免费视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩精品青青久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 麻豆国产97在线/欧美| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美色视频一区免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 不卡一级毛片| АⅤ资源中文在线天堂| 99久久国产精品久久久| 国产精品99久久久久久久久| 日本 av在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费无遮挡裸体视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美激情在线99| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产午夜精品久久久久久| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品野战在线观看| 午夜福利18| 制服丝袜大香蕉在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品国产高清国产av| 欧美在线黄色| 亚洲精华国产精华精| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av成人av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久中文| 欧美日本亚洲视频在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美激情久久久久久爽电影| 99热只有精品国产| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲成av人片在线播放无| 精品人妻1区二区| 久久中文字幕一级| 色av中文字幕| h日本视频在线播放| 丰满的人妻完整版| 精品一区二区三区视频在线 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品爽爽va在线观看网站| xxxwww97欧美| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产日本99.免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产欧美日韩一区二区三| 久久九九热精品免费| 日日夜夜操网爽| 男人舔奶头视频| 国产精品女同一区二区软件 | 精品国产美女av久久久久小说| 欧美在线一区亚洲| 欧美丝袜亚洲另类 | 99国产极品粉嫩在线观看| 极品教师在线免费播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品国产亚洲在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 色尼玛亚洲综合影院| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99在线人妻在线中文字幕| 无人区码免费观看不卡| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 热99在线观看视频| 在线观看免费午夜福利视频| 曰老女人黄片| 九色成人免费人妻av| 老司机午夜十八禁免费视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 黄色女人牲交| 麻豆国产av国片精品| 亚洲午夜理论影院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜福利视频1000在线观看| 在线国产一区二区在线| 久久99热这里只有精品18| 国产亚洲精品久久久com| 国产av麻豆久久久久久久| 国产三级在线视频| 国产精品久久视频播放| 国产1区2区3区精品| 美女免费视频网站| 久久久国产成人免费| 国产亚洲精品一区二区www| 国产不卡一卡二| 一边摸一边抽搐一进一小说| 91九色精品人成在线观看| 国产高清激情床上av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 无限看片的www在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| www.www免费av| 99精品在免费线老司机午夜| 美女大奶头视频| 国产精品久久视频播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 真人一进一出gif抽搐免费| netflix在线观看网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av成人av| 日本在线视频免费播放| 999精品在线视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 久9热在线精品视频| 亚洲专区字幕在线| 亚洲av免费在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| www日本在线高清视频| 最新中文字幕久久久久 | 欧美极品一区二区三区四区| 99国产精品一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 美女黄网站色视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品 欧美亚洲| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲自拍偷在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 嫩草影院精品99| 黄色片一级片一级黄色片| 一级毛片精品| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 操出白浆在线播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 美女午夜性视频免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲专区字幕在线| 哪里可以看免费的av片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久视频播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产三级在线视频| 亚洲黑人精品在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99国产精品一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美中文日本在线观看视频| 在线观看舔阴道视频| 色在线成人网| 国产黄色小视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一a级毛片在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 婷婷精品国产亚洲av| 黄色女人牲交| 亚洲五月婷婷丁香| 免费在线观看日本一区| 国产三级中文精品| av在线天堂中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9| 不卡av一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产高清videossex| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费观看精品视频网站| 亚洲美女黄片视频| 免费搜索国产男女视频| xxx96com| 精品电影一区二区在线| or卡值多少钱| 成人三级做爰电影| 女同久久另类99精品国产91| 免费av毛片视频| 精品欧美国产一区二区三| 国产亚洲精品av在线| 美女午夜性视频免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色丝袜av网址大全| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品一区av在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美大码av| 欧美又色又爽又黄视频| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久欧美精品欧美久久欧美| av在线天堂中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 成年版毛片免费区| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美乱妇无乱码| 色综合婷婷激情| 亚洲成人中文字幕在线播放| 夜夜爽天天搞| 制服人妻中文乱码| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 俺也久久电影网| 中文字幕高清在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美三级亚洲精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| aaaaa片日本免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜免费激情av| 99久久精品一区二区三区| 精品久久久久久,| 丝袜人妻中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久人人精品亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 九色国产91popny在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| a在线观看视频网站| 日韩国内少妇激情av| 久久久久久大精品| 国产精品电影一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美三级三区| av黄色大香蕉| 久久久成人免费电影| 欧美黄色淫秽网站| 一区二区三区激情视频| 国产精品精品国产色婷婷| 久久伊人香网站| 欧美日韩黄片免| 亚洲av成人av| 色视频www国产| 日本成人三级电影网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月玫瑰六月丁香| 女警被强在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品影院6| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 天天添夜夜摸| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男女视频在线观看网站免费| 国产探花在线观看一区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 香蕉国产在线看| 欧美日韩国产亚洲二区| a级毛片a级免费在线| 国产精品野战在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产欧美人成| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品,欧美在线| 日本三级黄在线观看| av国产免费在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 此物有八面人人有两片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 97碰自拍视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 熟女人妻精品中文字幕| 男人舔奶头视频| 99久久国产精品久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 成年免费大片在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 两人在一起打扑克的视频| 99国产极品粉嫩在线观看| x7x7x7水蜜桃| 国产三级在线视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美3d第一页| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久国产成人精品二区| 午夜福利18| 最新在线观看一区二区三区| 在线视频色国产色| 校园春色视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产高清三级在线| 国产成人福利小说| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成在线人永久免费视频| 99国产精品一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 又大又爽又粗| 国内精品美女久久久久久| 精品一区二区三区视频在线 | 国产私拍福利视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲午夜理论影院| 一夜夜www| 国产精品乱码一区二三区的特点| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 1024手机看黄色片| 久久精品人妻少妇| 成人鲁丝片一二三区免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品久久电影中文字幕| 美女黄网站色视频| 国产激情欧美一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 超碰成人久久| 日本 欧美在线| 又紧又爽又黄一区二区| 好男人在线观看高清免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 熟女人妻精品中文字幕| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产69精品久久久久777片 | 淫妇啪啪啪对白视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 窝窝影院91人妻| 亚洲中文av在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久末码| 欧美三级亚洲精品| 午夜激情欧美在线| 成人三级黄色视频| 亚洲第一电影网av| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜亚洲福利在线播放| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜免费激情av| 悠悠久久av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久人人精品亚洲av| 成熟少妇高潮喷水视频| 黄片小视频在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 在线国产一区二区在线| 国产精品av久久久久免费| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产精品成人综合色| 精品不卡国产一区二区三区| 成人av在线播放网站| 欧美又色又爽又黄视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产蜜桃级精品一区二区三区| xxx96com| 久久久久久大精品| 日韩精品中文字幕看吧| 日本一二三区视频观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 在线永久观看黄色视频| 免费在线观看日本一区| 叶爱在线成人免费视频播放| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人影院久久av| 国产高清视频在线播放一区| 性欧美人与动物交配| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 九色国产91popny在线| 床上黄色一级片| 91在线观看av| 亚洲黑人精品在线| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久性生活片| 亚洲美女视频黄频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲av电影在线进入| 超碰成人久久| 亚洲五月婷婷丁香| 精品人妻1区二区| 国产激情久久老熟女| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文资源天堂在线| 久久亚洲真实| 999精品在线视频| 久久久久性生活片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 久久亚洲精品不卡| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久色成人| 日韩欧美精品v在线| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产成+人综合+亚洲专区| 91久久精品国产一区二区成人 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 99久国产av精品| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产av在哪里看| 日本黄色片子视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久国产欧美日韩av| 99久久精品国产亚洲精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品 国内视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 制服丝袜大香蕉在线| 香蕉久久夜色| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美午夜高清在线| 伦理电影免费视频| 亚洲av美国av| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产高清视频在线观看网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男女那种视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久久久久免费视频了| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 十八禁网站免费在线| 国产精品电影一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成人福利小说| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黑人操中国人逼视频| 黄色视频,在线免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美免费精品| 日本熟妇午夜| 色播亚洲综合网| 99视频精品全部免费 在线 | av天堂在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 曰老女人黄片| 国产美女午夜福利| 婷婷六月久久综合丁香| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产欧美人成| 婷婷精品国产亚洲av| 三级毛片av免费| 久久久成人免费电影| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品人妻1区二区| 天堂影院成人在线观看| 亚洲九九香蕉| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 热99re8久久精品国产| 久久亚洲精品不卡| 午夜日韩欧美国产| 成人无遮挡网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产午夜福利久久久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| www日本在线高清视频| 在线观看日韩欧美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 国产高清视频在线观看网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 最近在线观看免费完整版| 欧美在线黄色| 99精品在免费线老司机午夜| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美国产在线观看| 欧美日韩乱码在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 特大巨黑吊av在线直播| 国产三级黄色录像| 麻豆成人av在线观看| 美女高潮的动态| 国产成年人精品一区二区| 岛国在线观看网站| 三级毛片av免费| 色吧在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 男插女下体视频免费在线播放| 成人三级黄色视频| 99久久精品一区二区三区| 成人无遮挡网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品 国内视频| 国产男靠女视频免费网站| 天堂网av新在线| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜福利在线在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久热在线av| 国产成人精品久久二区二区91| 老汉色∧v一级毛片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 最新中文字幕久久久久 | 色综合亚洲欧美另类图片| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲av高清不卡| 久久久久国产一级毛片高清牌| 床上黄色一级片| 欧美日韩综合久久久久久 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲第一电影网av| 欧美日韩乱码在线| 亚洲专区中文字幕在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人午夜高清在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口|