小細胞肺癌干細胞樣細胞的分離鑒定

高全立 汪萍

河南省腫瘤醫(yī)院生物治療科，*血液科，河南 鄭州450008

腫瘤干細胞理論提出在腫瘤組織中存在有少量腫瘤干細胞。類似于正常干細胞，腫瘤干細胞也具有自我復制和分化功能，對傳統(tǒng)的治療方法如放療和化療不敏感，它們是腫瘤轉移和復發(fā)的根源［1］。最近幾年的研究證實在多種腫瘤中存在有腫瘤干細胞［2］。乳腺癌干細胞和腦膠質瘤干細胞是較早發(fā)現的實體腫瘤干細胞，對它們的生物學特性已有比較深入的研究［3-4］。肺癌無論在我國和全球都是發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，然而關于人肺癌干細胞研究的文獻非常少，僅有少數幾篇文獻報道CD133為肺癌的干細胞標記［5］。為了研究小細胞肺癌干細胞的生物學特性，我們應用新型無血清培養(yǎng)基從新鮮切除的肺癌組織中培養(yǎng)了原代腫瘤細胞，并成功傳代建立了細胞系。應用流式細胞分析及分選技術，我們首次鑒定出CD44及CD90可能為小細胞肺癌的干細胞標記，并對它們的生物學特性進行了研究。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 Defined K-SFM 無血清培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、RPMI 1640、PBS、TrypLEEMExpress等購自Invitrogen 公司。超低黏附的96孔培養(yǎng)板、普通培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板均購自Corning公司。EGF（表皮生長因子）和bFGF（堿性成纖維生長因子）購自Peprotech公司。CD44-FITC、CD90-APC及相應的同型對照抗體購自BD公司。

1.2 原代細胞的培養(yǎng)及建系 新鮮手術切除的肺癌組織，在6孔板中用含青霉素及鏈霉素的RPMI 1640反復沖洗并剔除壞死組織后，用無菌剪刀反復剪切成約1 mm3大小的組織塊。收集剪切后的腫瘤組織置于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用含有Ⅱ型膠原酶400 U/mL的Defined K-SFM 無血清培養(yǎng)基在CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中37 ℃消化3 h后，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞為單個細胞，用RPMI 1640洗滌，300×g離心3次徹底去除膠原酶。收集消化后的肺癌細胞，用含EGF 20 ng/mL、bFGF 10 ng/mL 的Defined K-SFM培養(yǎng)基懸浮細胞并轉移到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在含CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每3天換新鮮培養(yǎng)基1次。當細胞生長到80%融合時，用TrypLEEMExpress消化后傳代。培養(yǎng)的前4代細胞在傳代時每次都保留部分細胞凍存于液氮中。

1.3 免疫組織化學 將培養(yǎng)的細胞用胰酶消化后收集到離心管中，500×g離心10 min。去除上清液后在細胞團中加入2滴血漿和凝血酶混勻1 mim。血漿凝固后加入4%的甲醛固定30 mim，細胞團取出后用石蠟包埋。然后用常規(guī)的免疫組化方法檢測P53、CK5、CD44和AE1在腫瘤細胞中的表達情況。

1.4 流式細胞學分析及分選腫瘤干細胞 于75 cm2培養(yǎng)瓶中原代培養(yǎng)后取傳代在4代以內對數生長期的肺癌細胞，PBS沖洗2次后，加入2 mL的TrypLEEMExpress室溫消化6 min。收集消化后的單個細胞，PBS洗滌2次，調細胞濃度為1×107個/mL，分別加入CD133-FITC及CD90-APC抗體溫育20 min，最后用RPMI 1640 洗滌2次。用1 mL的RPMI1640懸浮細胞，過40 μm的無菌篩網，加PI至終濃度為1 μg/mL放置冰上待分析分選。在同樣的條件下標記同型對照抗體細胞組。

應用FACSAria Ⅱ流式細胞儀 （美國BD Bioscience公司）分析分選待檢的細胞。細胞樣品上機后，收集5萬個細胞應用BD FACSDiva軟件分析。首先根據細胞的前向角和側向角特性，圈出為單個且有活性的細胞群，再進一步圈出PI-的細胞群，對比同型對照抗體組的細胞，依據不同抗體的熒光標記特性，圈出所要分析的細胞。最后將所選的細胞無菌分選到分選管中。

1.5 單細胞克隆形成試驗 用流式細胞儀將單個細胞直接分選到96孔板中，每孔1個細胞，用200 μL/孔的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細胞設120個復孔。分選后用倒置顯微鏡觀察，將只含有1個細胞的孔標記。以后每3天換液1次，定期觀察各孔中形成細胞克隆的特性并計數照相。

1.6 平板集落形成試驗 流式細胞儀分選的細胞計數后接種到6孔板中，每孔250個細胞，用2 mL的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細胞設3個復孔。以后每隔3天換液1次，并定期用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞形成集落的狀況。當大部分集落增長的細胞數目大于100個時，停止培養(yǎng)并用結2%的結晶紫染色。具體染色步驟為：先用PBS小心沖洗細胞1次，4%甲醛室溫固定30 min，PBS再沖洗2次，2%結晶紫染色1 h，清水沖洗后照相并計數每孔中細胞集落的數目。

1.7 細胞球形成實驗 將分選的細胞培養(yǎng)于超低黏附的96孔培養(yǎng)板中，每孔100個細胞，用200 μL/孔的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細胞設10個復孔。以后每隔2天換液1次，換液時小心吸取每孔中上層培養(yǎng)液60 μL，然后再補加60 μL新鮮培養(yǎng)液。定期用倒置顯微鏡觀察各個孔中形成細胞球的情況并記錄照相。每大于50個細胞的細胞團計數為1個細胞球。

1.8 統(tǒng)計處理 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 小細胞肺癌的原代培養(yǎng)和傳代建系 將1例來源于小細胞肺癌的腫瘤組織經Ⅱ型膠原酶消化為單個細胞后，在含有EGF和bFGF的Defined K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天，培養(yǎng)瓶中開始出現典型貼壁生長的上皮細胞。該培養(yǎng)體系能選擇性生長腫瘤上皮細胞，幾乎沒有成纖維細胞的生長（圖1）。當細胞生長的密度達到80%融合時，經特殊的胰酶消化后細胞可成功傳代建立細胞系，將其命名為LC004。該細胞系細胞的生長速度較快，在1∶10比例傳代的情況下，每4天即可傳代1次。到目前為止，該細胞系已穩(wěn)定傳代到25代以上。這個小細胞肺癌細胞系的建立為以后肺癌干細胞的分離鑒定打下了良好的基礎。為了較好地反映原位肺癌細胞的功能，以下試驗中所選用的細胞均為細胞系中第3、4代的細胞。

2.2 免疫組織化學鑒定培養(yǎng)的小細胞肺癌細胞 我們對培養(yǎng)的細胞用免疫組織化學的方法進行了初步鑒定，結果顯示培養(yǎng)的細胞表達AE-1、CK-5、P53和CD44（圖2）?？紤]到我們從腫瘤組織中培養(yǎng)的細胞在1∶10比例傳代的情況下能穩(wěn)定傳代到25代以上，且培養(yǎng)的細胞表達P53，這些細胞應是小細胞肺癌細胞。

圖2 建立的細胞系表達AE1（A）、CK5（B）、P53（C）和CD44（D）Fig.2 Established cell line expressed AE1(A), CK5(B), P53(C) and CD44(D)(×200)

2.3 小細胞肺癌細胞系中部分細胞高表達CD44 為了尋找可能的肺癌干細胞標記，我們首先用CD44-FITC標記腫瘤細胞后進行流式細胞學分析，發(fā)現細胞可被分為2群，其中一小群細胞（圖3的P3細胞群，約有5.1%）明顯高表達CD44（CD44++），從流式細胞學上分析這群細胞具有干細胞的特性，表現為所占細胞群的比例較低，細胞直徑較小，而主群細胞為CD44+的細胞（圖3的P2細胞群）。

圖3 CD44-FITC標記后流式細胞分析小細胞肺癌細胞系LC004Fig.3 Flow cytometry analysis of CD44-FITC stained small cell lung cancer cell line LC004

2.4 只有CD44++的小細胞肺癌細胞可形成完全克隆 將1個細胞接種于96孔板的1個孔中，經過2周培養(yǎng)后觀察到CD44++細胞和CD44+細胞形成的克隆特性有明顯不同。CD44++可形成3種克隆，其中1種克隆的細胞排列緊密，細胞體積較小，形成的克隆直徑較大，這樣的克隆為完全克隆（holoclone）；與完全克隆相反，另一種克隆的細胞排列稀疏，細胞體積較大，形成的克隆直徑較小，這樣的克隆為流產克?。╬araclone）；介于兩者之間的克隆為部分克隆（meroclone）（圖4）。文獻報道只有腫瘤干細胞可形成完全克?。?］。與CD44++細胞不同，CD44+細胞只能形成部分克隆和流產克隆。這些結果提示CD44++的肺癌細胞可能富集了腫瘤干細胞。

2.5 CD44++細胞具有較強的集落形成能力將250個分選的細胞接種到6孔板中的1個孔中，CD44++細胞形成的集落數為45.7±4.2，CD44+細胞形成的集落數為18.3±4.7，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。且CD44++細胞形成的集落直徑較大，細胞排列密集（圖5）。

圖4 CD44++肺癌細胞形成的3種克隆Fig.4 Three clones formed from CD44++ lung cancer cells(×100)

圖5 CD44++和CD44+細胞在6孔板中形成的集落Fig.5 Colonies formed from CD44++ and CD44+ cells in 6 well plates

2.6 細胞球形成試驗 為了進一步證實只有CD44++細胞中富集了腫瘤干細胞，我們進行了細胞球形成試驗。結果發(fā)現當100個/孔的細胞，在超低黏附的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)19 d后，7/10孔中的CD44++細胞可以增殖形成細胞球（圖6A），而CD44+細胞不能形成任何一個細胞球，且培養(yǎng)的過程中細胞逐漸死亡（圖6B）。

圖7 CD44-FITC和CD90-APC雙標記小細胞肺癌細胞后流式細胞分析的結果Fig.7 Flow cytometry analysis of small cell lung cancer cell line co-stained with CD44-FITC and CD90-APC

2.7 CD90可能是小細胞肺癌的干細胞標記為了尋找更多的肺癌干細胞標記，我們用CD44-FITC和CD90-APC共同標記腫瘤細胞進行流式細胞儀分析，結果發(fā)現小細胞肺癌細胞可被分為4群，分別為CD44+CD90-、CD44+CD90+、CD44++CD90-和CD44++CD90+，其中CD44++CD90+細胞所占比例為1.9%。為了檢測CD44++CD90+細胞是否富集了最多的肺癌干細胞，我們比較了CD44+（含CD44+CD90-及CD44+CD90+細胞，圖7的P2細胞群）、CD44++CD90-（圖7的P3細胞群）及CD44++CD90+（圖7的P4細胞群）細胞的細胞球形成能力。結果CD44+細胞仍不能形成任何細胞球，9/10的CD44++CD90+細胞孔中可形成細胞球，而只有1/10的CD44++CD90+細胞孔中可形成細胞球。這些結果提示CD44++CD90+富集了最多的腫瘤干細胞，CD44++CD90-群細胞中可能也含有少量的腫瘤干細胞，而CD44+CD90+和CD44+CD90-群細胞中沒有腫瘤干細胞。

3 討 論

關于腫瘤干細胞的分離鑒定，目前常用的方法有直接從新鮮腫瘤組織中分離、從已有的穩(wěn)定建立的腫瘤細胞系中分離和從原代培養(yǎng)的腫瘤細胞中分離。從新鮮切除的腫瘤組織中直接分離的腫瘤干細胞能較真實地反映原位腫瘤干細胞的生物學特性，但由于新鮮切除的腫瘤組織中含有多種細胞成分，且多數分離到的腫瘤干細胞不能在體外培養(yǎng)，這些缺點使腫瘤干細胞的分離鑒定工作變得十分艱難，對其生物學特性進行研究也很困難。從已有穩(wěn)定建立的腫瘤細胞系中分選腫瘤干細胞取材容易，操作相對簡單，但由于細胞系經過長期體外或動物體內傳代，其中的腫瘤干細胞可能已發(fā)生很大變異，分離到的腫瘤干細胞不一定能真實反映原位腫瘤干細胞的生物學特性。而從原代培養(yǎng)或經體外短期傳代培養(yǎng)的腫瘤細胞中分離的腫瘤干細胞可以解決上述兩種分離方法的局限性，但由于腫瘤細胞的原代培養(yǎng)十分困難，限制了該技術的廣泛應用。本研究中我們應用一種特殊的無血清培養(yǎng)基，成功地從1例小細胞肺癌組織中培養(yǎng)出了純度很高的原代肺癌細胞，且細胞很容易傳代擴增到25代以上。有文獻報道應用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的腫瘤細胞呈懸浮的細胞球生長，且細胞一旦貼壁后腫瘤干細胞就會發(fā)生分化［7］。我們應用Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的小細胞肺癌細胞均為典型的貼壁細胞，而我們的試驗結果支持肺癌干細胞存在于這些貼壁生長的細胞中。從試驗操作的過程來看，從貼壁的細胞中分離腫瘤干細胞較從細胞球中分離腫瘤干細胞更容易可行。該細胞系的建立為我們后續(xù)的腫瘤干細胞分離鑒定工作打下了良好的基礎。

腫瘤干細胞和正常干細胞往往具有相同的干細胞標記。CD44是間充質干細胞的標記，也是多種腫瘤干細胞的標記［8］，但CD44是否是肺癌的干細胞標記尚無文獻報道。本研究中我們首先用流式細胞儀檢測了CD44在原代建立的小細胞肺癌細胞系中的表達情況，結果發(fā)現幾乎所有的細胞都表達CD44，但其中約5.1%的細胞CD44明顯強陽性表達，且它們的直徑較小，符合腫瘤干細胞的特點。為了驗證CD44強陽性的細胞是否具有腫瘤干細胞的特點，我們用流式細胞儀分選了CD44++和CD44+的細胞并研究它們的生物學特性，結果發(fā)現只有CD44++細胞可以形成完全克隆，而CD44+細胞只能形成部分克隆和流產克隆。文獻報道只有腫瘤干細胞可以形成完全克隆，祖細胞可以形成部分克隆，而終末分化的細胞不能形成克隆或只能形成流產克?。?］。這些結果提示小細胞肺癌干細胞富集在CD44++的細胞群中。與單細胞克隆的結果相似，在平板集落形成試驗中，CD44++形成的集落明顯多于CD44+細胞，且CD44++細胞形成的集落直徑較大，細胞排列緊密，說明CD44++細胞具有較強的增殖能力。在超低黏附的培養(yǎng)板上能形成細胞球是腫瘤干細胞的主要特點之一［9］。在我們的試驗結果中，只有CD44++的細胞可以形成細胞球，而CD44+細胞不能形成細胞球，進一步證明了肺癌干細胞富集在CD44++細胞中。

CD90是間充質干細胞的表面標記，也是肝癌干細胞的表面標記［10］。在本研究中我們發(fā)現，當用CD44和CD90共同標記小細胞肺癌細胞時，有1.9%的肺癌細胞的表達標記為CD44++CD90+。為了驗證肺癌干細胞是否富集在CD44++CD90+細胞中，我們重點比較了CD44++CD90+和CD44++CD90-細胞的細胞球形成能力，結果CD44++CD90+形成細胞球的能力是CD44++CD90-細胞的8倍，而CD44+CD90+和CD44+CD90-細胞均不能形成細胞球，這些結果提示肺癌干細胞主要在CD44++CD90+細胞群中。

本研究借助于我們建立的原代腫瘤細胞培養(yǎng)技術，首次證實小細胞肺癌干細胞高表達CD44和CD90，并成功分離到了小細胞肺癌干細胞樣細胞，為下一步深入研究肺癌干細胞的生物學特性和尋找有效的肺癌治療方法打下了較好的基礎。

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