黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化動(dòng)態(tài)

徐慶華 胡寶忠 李鳳蘭

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

黃瓜（Cucumis sativusL. 2n=2x=14）為葫蘆科一年蔓生草本植物，是重要的蔬菜作物之一。合理的株型是黃瓜高產(chǎn)品種的生育基礎(chǔ)，矮生性狀是理想株型的一個(gè)重要方面，大多具矮生性狀的品系抗倒伏能力強(qiáng)，適于密植（胡寶忠 等，2010）；分枝多少是黃瓜的另一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，分枝長勢過強(qiáng)，影響主蔓生長，同時(shí)也給黃瓜生產(chǎn)管理帶來諸多不便；通過有目的地調(diào)控分枝生長以提高開花和結(jié)實(shí)數(shù)量已成為增產(chǎn)的重要手段之一（蔣蘇 等，2009）。目前國內(nèi)傾向于利用分枝長勢較弱的品系，因此研究分枝性狀對于黃瓜生產(chǎn)中培育出分枝少、長勢弱的品系有一定的意義；國外為了便于利用機(jī)器人采收，也有特別選用和培育分枝長勢極強(qiáng)品系的報(bào)道（van Henten et al.，2002）。分枝的發(fā)生出現(xiàn)于主莖軸葉片的葉腋中，首先腋生分生組織分化產(chǎn)生腋芽；腋芽再進(jìn)一步生長發(fā)育形成側(cè)枝，但是腋芽有可能迅速地發(fā)育成營養(yǎng)枝或一直保持休眠狀態(tài)直到生長被觸發(fā)，因此分枝的程度不僅取決于腋生分生組織的生長，還取決于腋芽的發(fā)育過程。近年來基于分枝性狀突變體的研究，擬南芥、豌豆、番茄、牽?；?、水稻等作物的分枝性狀的報(bào)道和成果較多；由于黃瓜分枝性狀突變體的缺乏，對黃瓜分枝性狀的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。對黃瓜矮化突變體的研究方面，也多集中在矮化形成的機(jī)理上（武濤 等，2009），對突變體的分枝性狀很少關(guān)注，至今尚未見關(guān)于黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化的形態(tài)解剖學(xué)報(bào)道。本試驗(yàn)選擇黃瓜矮化突變體D0462為材料，通過觀察D0462的生態(tài)學(xué)特點(diǎn)和采用石蠟切片法觀察黃瓜矮化突變體營養(yǎng)芽莖尖分生組織的分化過程，為篩選合適的黃瓜分枝性狀突變體、進(jìn)一步開展黃瓜分枝性狀的生理生化和分子水平的研究提供解剖學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組的高代自交矮化品系D0426，以普通蔓生品系D9419為對照。

1.2 供試試劑和儀器設(shè)備

番紅、固綠、酒精、二甲苯、甲醛、甘油、中性樹膠等試劑均為分析純，購自哈爾濱嘉實(shí)化學(xué)試劑公司；展片機(jī)（ZPJ-1A）、磨刀機(jī)（MDJ-4型）、旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（LEICA RM2245型）、恒溫箱（DHP-9162型）、顯微鏡（Motic BA3000）和顯微攝像裝置（Motic Images advanced 3.2）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣 2008～2010年連續(xù)3 a將供試材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站連棟溫室。采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每小區(qū)20株，株距25 cm，行距60 cm，栽培條件一致。每小區(qū)選15株進(jìn)行調(diào)查。所有性狀都進(jìn)行單株測定，用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2010年3月21日子葉出土，從3月23日開始每隔1 d取材1次，共取9次。用鑷子和解剖針從頂端莖尖中小心剝出生長點(diǎn)，迅速放入FAA固定液中。取FAA固定的材料，經(jīng)系列酒精脫水，石蠟包埋片厚度10 μm，番紅-固綠染色。Motic BA3000顯微鏡觀察、Motic Images advanced 3.2軟件（Motic China group Co.，LTD）照相和測量。

1.3.2 莖尖分生組織分化狀態(tài)的判斷指標(biāo) 參考張兆軍等（2008）對羊草營養(yǎng)芽莖尖分生組織分化的研究結(jié)果，將莖尖分生組織不同分化時(shí)期的形狀分為初生期、伸長期和結(jié)節(jié)期。判別依據(jù):① 初生期。莖尖分生組織的寬度和長度相近，后一個(gè)原基突起的出現(xiàn)是在前一個(gè)原基（幼葉）已經(jīng)超過了莖尖分生組織的頂部，且后一個(gè)原基的生長方向較上豎，與莖尖分生組織的中軸成銳角。② 伸長期。莖尖分生組織略伸長，后一個(gè)原基突起的出現(xiàn)是在前一個(gè)原基（幼葉）還沒超過莖尖分生組織的頂部，且后一個(gè)原基的生長方向較下垂，與莖尖分生組織的中軸成鈍角。③ 結(jié)節(jié)期。莖尖分生組織明顯伸長，在莖尖分生組織表面形成許多小突起。

1.3.3 營養(yǎng)芽莖尖分生組織大小的測量 采用麥克奧迪公司生產(chǎn)的Motic BA300型生物顯微鏡進(jìn)行成像，莖尖分生組織的直徑、高度測量用Motic Images advanced 3.2軟件進(jìn)行。各時(shí)期的黃瓜營養(yǎng)芽莖尖分生組織直徑和高度測量方法:在葉原基之上所劃橫向直線為莖尖分生組織直徑，與橫向直線垂直的最大縱向直線為莖尖分生組織高度。黃瓜營養(yǎng)芽莖尖分生組織的初生期、伸長期和結(jié)節(jié)期的大小為測量36個(gè)完好圖片的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

3 a的田間調(diào)查結(jié)果顯示，D0462和D9419兩個(gè)品系的黃瓜在株高、分枝性狀和葉面積等方面有明顯的差異（圖版I-1～4、表1）。

表1 供試黃瓜品系形態(tài)學(xué)比較

圖版I 黃瓜形態(tài)學(xué)觀察

D0462營養(yǎng)芽常著生于花序軸（簇）之上（圖版Ⅰ-5），營養(yǎng)芽一旦形成都能夠伸長形成側(cè)枝，不存在休眠或抑制伸長的現(xiàn)象；第1側(cè)枝起始節(jié)位為第1～2節(jié)，隨后每節(jié)都萌發(fā)出側(cè)枝；四葉一心期幼苗（圖版Ⅰ-6）第1節(jié)就可觀察到花（序）芽，花芽發(fā)育正常（圖版Ⅰ-7）；成熟植株花器官正常，葉腋處花芽最多可達(dá)22個(gè)（圖版Ⅰ-8），果實(shí)短棒狀（圖版Ⅰ-9），植株自封頂（圖版Ⅰ-10）。

D9419植株第1側(cè)枝起始節(jié)位為第8～9節(jié)，葉腋處會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)芽。但是營養(yǎng)芽的著生位置與D0462不同，直接著生于葉腋部位（圖版Ⅰ-11）；花器官正常，果實(shí)長棒狀（圖Ⅰ-12），非自封頂。D9419四葉一心期幼苗第1節(jié)位無營養(yǎng)芽和花芽分化（圖版Ⅰ-13）。

2.2 顯微解剖觀察

結(jié)合莖尖分生組織分化判別依據(jù)，石蠟切片法觀察D0462和D9419兩個(gè)品系莖尖生長的動(dòng)態(tài)過程，結(jié)果顯示:莖尖的生長分為營養(yǎng)生長和生殖生長。D0462和D9419兩個(gè)品系莖尖營養(yǎng)生長經(jīng)歷 3個(gè)時(shí)期:① 初生期。莖尖分生組織的寬度和高度相近，葉腋分生組織逐漸發(fā)育成側(cè)芽原基，側(cè)芽原基發(fā)育成幼葉前生長方向與莖尖分生組織的中軸成銳角（D0462見圖版Ⅱ-1～2；D9419見圖版Ⅱ-10～12）。② 伸長期。莖尖分生組織寬度和高度都略伸長，但高度伸長的更多，后一個(gè)側(cè)芽原基突起的出現(xiàn)是在前一個(gè)側(cè)芽原基還沒超過莖尖分生組織的頂部，且后一個(gè)原基的生長方向與莖尖分生組織的中軸成鈍角（D0462見圖版Ⅱ-3～5；D9419見圖版Ⅱ-13～15）。③ 結(jié)節(jié)期。莖尖分生組織高度明顯伸長，在莖尖分生組織表面出現(xiàn)小突起（D0462見圖版Ⅱ-6；D9419見圖版Ⅱ-16～17）。

雖然D0462和D9419兩個(gè)品系莖尖生長都會(huì)經(jīng)歷上述3個(gè)時(shí)期，但是分化進(jìn)程不一樣（表2）。D0462在營養(yǎng)生長的3個(gè)時(shí)期分化比D9419快:① D0462的莖尖分生組織進(jìn)入伸長期（3月27日）比D9419（3月29日）早2 d；② D0462的莖尖分生組織進(jìn)入結(jié)節(jié)期（4月2日）比D9419（4月4日）早2 d，并且D0462的部分結(jié)節(jié)期的莖尖由營養(yǎng)頂端轉(zhuǎn)變?yōu)樯稠敹耍c前期相比，頂端變成伸長的圓頂形，進(jìn)入生殖生長（圖版Ⅱ-6）；③ D0462的莖尖從4月4日開始分化苞片和花原基，開始花序分化（圖版Ⅱ-7），4月6日已經(jīng)可以明顯看到花芽的分化（圖版Ⅱ-8～9），截至4月8日D9419的莖尖分生組織未轉(zhuǎn)變?yōu)樯稠敹恕⑽催M(jìn)入生殖生長階段（圖版Ⅱ-17）。

表2 D0462和D9419莖尖分化進(jìn)程比較

2.3 矮化突變體D0462莖尖分生組織不同分化時(shí)期的大小

由黃瓜矮化突變體莖尖分生組織不同分化時(shí)期大小的測定結(jié)果得出（表 3）:初生期莖尖分生組織直徑平均值為148.2 μm，最小值和最大值分別為167.3 μm和202.7 μm；高度平均值為105.8 μm，其最小值和最大值分別為89.0 μm和118.0 μm；直徑與高度的比值為1.40，初生期的莖尖分生組織是直徑大于高度。伸長期莖尖分生組織的直徑平均值為 153.1 μm，最小值和最大值分別為 133.6 μm和175.3 μm；高度的平均值為 197.5 μm，最小值和最大值分別為158.0 μm和244.8 μm；直徑與高度的比值為0.78，與初生期相比，直徑與高度雖都已增加，但伸長期莖尖分生組織的直徑已小于高度，說明莖尖分生組織高度的發(fā)育速度大于直徑。結(jié)節(jié)期莖尖分生組織的直徑平均值為 197.7 μm，最小值和最大值分別為140.2 μm和289.0 μm；高度平均值為 360.0 μm，最小值和最大值分別為 260.0 μm和 600.1 μm；直徑與高度的比值為0.55，莖尖分生組織的直徑和高度在繼續(xù)增加的同時(shí)，結(jié)節(jié)期莖尖分生組織高度的增加速度在進(jìn)一步加快。

圖版II 黃瓜莖尖分生組織分化的動(dòng)態(tài)顯微觀察

表3 矮化突變體D0462營養(yǎng)芽莖尖分生組織不同分化時(shí)期的大小

3 結(jié)論與討論

蔣蘇等（2009）研究黃瓜無側(cè)枝品系S61的形態(tài)解剖學(xué)觀察時(shí)指出，無側(cè)枝品系S61的營養(yǎng)芽著生于花序軸上，S61所有的側(cè)枝都是由花序逆轉(zhuǎn)而來；而有側(cè)枝品系 S06營養(yǎng)芽直接著生于葉腋部位。本研究發(fā)現(xiàn)少分枝的D9419營養(yǎng)芽直接著生于葉腋部位；多分枝的D0462營養(yǎng)芽常著生于花序軸（簇）之上，營養(yǎng)芽一旦形成都能夠伸長形成側(cè)枝，不存在休眠或抑制伸長的現(xiàn)象。模式植物擬南芥不僅從主莖上分枝，也可從蓮座狀基部產(chǎn)生的腋生花序上分枝（劉進(jìn)平，2007）。植物分枝性狀會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響，包括營養(yǎng)、種植密度、光、溫度和水分等，同時(shí)還受到植株內(nèi)源激素的調(diào)控；D0462和D9419生長環(huán)境相同的前提下，D0462莖尖分生組織分化進(jìn)程快、較早進(jìn)入生殖生長階段是調(diào)控分枝性狀的基因表達(dá)和內(nèi)源激素共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。

植物的分枝發(fā)育大致可分為葉腋分生組織（AM）的形成和腋芽的生長發(fā)育。表現(xiàn)出多分枝性狀的擬南芥sps、bushy突變體，其分枝數(shù)目增多是由于形成的腋生分生組織數(shù)目增多引起的（杜黎明 等，2008）。然而多分枝的 D0462莖尖分生組織營養(yǎng)生長階段的 AM不比少分枝的D9419的AM多，所以推測對D0462多分枝表型調(diào)控發(fā)生在腋芽生長發(fā)育階段。目前，植物腋芽生長發(fā)育相關(guān)基因和這些基因的上下游基因，以及它們在莖分枝調(diào)控的不同遺傳途徑間的相互關(guān)系仍未研究清楚，主要原因是沒有足夠的突變體（杜黎明 等，2008）。目前鑒定的腋芽生長相關(guān)基因（CCDs）突變體包括水稻的htb1、擬南芥的max和axr1、豌豆的rms等，均表現(xiàn)出分枝數(shù)量與植株高度呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系（Ishikawa et al.，2005；Simons et al.，2007）。腋芽生長發(fā)育相關(guān)基因?qū)S瓜分枝性狀調(diào)控的研究尚未見報(bào)道，多分枝、矮化黃瓜D0462的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)研究可為黃瓜腋芽生長發(fā)育及黃瓜分枝性狀調(diào)控機(jī)理研究篩選突變體提供理論依據(jù)，進(jìn)一步豐富對植物分枝發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理解。

D0462莖尖分生組織的形狀分為初生期、伸長期和結(jié)節(jié)期；3個(gè)時(shí)期中，莖尖分生組織直徑/高度的值逐漸減小，進(jìn)入伸長期直徑/高度的值減少得最多，這也是判別莖尖分生組織進(jìn)入伸長期的主要標(biāo)準(zhǔn)。部分結(jié)節(jié)期D0462出現(xiàn)花芽分化，羊草結(jié)節(jié)期也有花芽分化（張兆軍 等，2008），所以可通過莖尖分生組織的大小來判斷是否進(jìn)入成花過程。

溫室中3月17日播種種植D0462，4月2日部分植株的莖尖分生組織進(jìn)入生殖生長階段，因此D0462是適于溫室、大棚栽培的早熟品系；植株分枝多、矮化、果實(shí)短棒狀，適于國外機(jī)器人采收并制作腌漬黃瓜。隨著以蔬菜為主題的觀光休閑農(nóng)業(yè)發(fā)展迅速，利用矮生番茄、羽衣甘藍(lán)、葉用甜菜等矮生蔬菜進(jìn)行盆栽造型，可增添整體觀賞效果，更重要的是增加溫室內(nèi)降溫效果，調(diào)節(jié)空氣濕度（曹華 等，2010）。D0462具有矮生、多分枝、早熟、花芽多等特性，可培育并造型為溫室內(nèi)矮生蔬菜盆景，增加矮生蔬菜盆景的種類。

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