白芍水提物對cAMP-磷酸二酯酶活性影響及其抗炎效果觀察

陳益山,鞏忠福,姜代勛,李 佳,陳 麗,任 超,穆 祥,陳 武

(1.獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206;2.北京農學院動物科學技術學院,北京 昌平 102206;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lacti f lora Pall)的干燥根,具有平肝止痛、養(yǎng)血調經、斂陰止汗之功效[1]。藥理研究表明,其有抗炎、解痙、護肝、免疫調節(jié)等作用。研究表明,臨床上常見炎癥性疾病多與中性粒細胞的炎性反應密切相關[2-3],而磷酸二酯酶(PDE)可以通過調節(jié)細胞內cAMP水平發(fā)揮抗炎作用[4],本試驗通過檢測白芍水提物對中性粒細胞PDE活性和炎癥病理模型的影響,分析其抗炎的相關機理與效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠60只,體重150～180 g,購于中國科學院遺傳與發(fā)育研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 cAMP、Rolipram、角叉菜膠、弗氏完全佐劑(Sigma公司),PBS(pH值7.4),鈣鎂PBS(pH值7.4),中藥白芍飲片(北京同仁堂藥店)。

1.3 白芍水提物的制備 白芍水提物的制備方法參照韓太云等人的方法[5],將購買的白芍飲片用蒸餾水淋洗1次,加蒸餾水煎煮2次,煎液減壓濃縮至1 g/mL生藥。加無水乙醇使其濃度達到70%,邊加邊攪拌,4℃放置24 h,取上清液用氫氧化鈉調pH值為7.5～8.0,放置12 h,取上清液揮發(fā)掉乙醇,將藥液濃縮至1 g/mL生藥。放置12 h,離心取上清液濃縮干燥,得白芍水提物。

1.4 中性粒細胞cAMP-PDE活性檢測 中性粒細胞cAMP-PDE活性影響的檢測方法參考張冰等的方法[6]。cAMP濃度為100 μ mol/L,白芍水提物的反應濃度為10 mg/mL,陽性對照為Rolipram,反應濃度為 100 μ mol/L,均用 PBS配制。空白組:cAMP 40μL,對照組 :cAMP 40μL 、酶樣品 20μL,白芍水提物組:cAMP 40μ L、白芍水提物 10μL、酶樣品 20μL,Rolipram 組:CAMP 40μ L 、Rolipram 10.0μL、酶樣品 20μL,所有體系加 PBS 補足100μL 。

1.5 大鼠角叉菜膠致足腫脹模型試驗 將大鼠隨機分成6組,每組10只。白芍水提物設高、中、低3個濃度,分別小鼠腹腔注射白芍水提物10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg體重;陽性對照組,腹腔注射Rolipram 2.75 mg/kg體重;正常對照組和模型組,腹腔注射等容積的生理鹽水。給藥30 min后,正常對照組每鼠右后足跖皮下注射0.1mL生理鹽水,其余各組每鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1mL造模。致炎前按照余華保等人[7]的玻璃容器法測定大鼠右后足跖的容積,致炎后2,4 h和6 h再測量3次,以mL為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖容積的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率,腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.6 大鼠佐劑性關節(jié)炎模型試驗 分組給藥同上1.5。正常對照組每鼠左后足跖皮下注射0.05mL的生理鹽水,其余各組每鼠左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.05mL造模。致炎前用千分尺測量大鼠左后足跖的厚度,致炎后3 h、6 h、15 h再測量3次,以mm為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖厚度的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率。

1.7 數據處理 數據分析采用樣本間t檢驗。

2 結果與分析

2.1 白芍水提物對中性粒細胞cAMP-PDE活性的影響 白芍水提物在10 mg/mL的反應濃度下,能極顯著的抑制cAMP-PDE4的活性(P＜0.001),其抑制率顯著高于Rolipram組。結果見表1。

表1 白芍水提物及Rolipram對cAMP-PDE活性的影響

2.2 白芍水提物對大鼠角叉菜膠致足腫脹的影響與空白對照組相比較,模型組致炎后大鼠足跖容積極顯著性變大(P＜0.001),說明造模成功。白芍水提物各濃度組及Rolipram組對大鼠足腫脹在致炎后2 h、4 h和6 h均有顯著抑制作用(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結果見表2和表3。

2.3 白芍水提物對大鼠佐劑性關節(jié)炎的影響 模型組大鼠左后足跖極顯著腫脹(P＜0.001)。白芍水提物各濃度組及Rolipram組給藥后的大鼠原發(fā)性足跖腫脹均受到顯著的抑制(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足跖腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結果見表4和表5。

3 討論

大部分研究報道所用白芍的成分都是通過有機溶劑乙醇萃取獲得[8],考慮到傳統(tǒng)中藥均采用水煎煮的方法,水溶性成分可能更能真正代表其傳統(tǒng)作用成分。因此,本試驗通過水提醇沉法提取了白芍中的水溶性成分,檢測其對cAMP-PDE活性的影響,觀察其抗炎效果并分析機理。

表2 白芍水提物對大鼠足腫脹的影響 (mL)

表3 白芍水提物各組大鼠足爪腫脹度(mL)和抑制率(%)

表4 白芍水提物對佐劑性關節(jié)炎大鼠足跖腫脹度的影響 (mm)

表5 白芍水提物各組大鼠足跖腫脹度(mm)和抑制率(%)

結果表明,白芍水提物對中性粒細胞中cAMPPDE活性具有極顯著的抑制作用。并且對大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關節(jié)炎的足腫脹兩種炎癥模型均顯示出了極顯著的抗炎效果,并與劑量呈正相關。大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關節(jié)炎的發(fā)生與炎癥局部中性粒細胞活化和浸潤及前列腺素E2合成增加有關[9-10],而cAMP具有抑制中性粒細胞活化及前列腺素 E2過度合成的作用。PDE是cAMP的惟一水解酶,對調節(jié)細胞PDE水平起著關鍵性作用。因此,白芍水提物的作用可能是通過抑制PDE活性,升高cAMP水平,進而抑制大鼠角叉菜膠致足腫脹和佐劑性關節(jié)炎的足跖腫脹部位中性粒細胞活化和浸潤及前列腺素E2增加,從而發(fā)揮良好的抗炎效果。

白芍水提物中含有的具體抗炎成分及臨床抗炎療效有待進一步研究。

[1]江蘇醫(yī)學院.中藥大詞典[M].上海:上?？茖W技術出版社,1998:706-708.

[2]Haslett C.Resoltion of acute inflammation and the role of apoptosis in the tissue fate of granulocy tes[J].Clin Sci,1992,83(3):639-648.

[3]Weiss S J.Tissue destruction by neutrophils[J].N Engl J Med,1989,320(6):365-376.

[4]姜健,龔炳永.環(huán)核苷酸磷酸二酯酶及其抑制劑的研究[J].國外醫(yī)藥:合成藥,生化藥制劑分冊,1998,19(3):131-138.

[5]韓太云,侯國平,張佐,等.雙黃連注射液的制備和質量控制方法的研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,1984,2:7980.

[6]張冰,姜代勛,陳武,等.犬中性粒細胞磷酸二酯酶活性及清熱藥對其影響的觀察[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(2):85-87.

[7]余華保,錢善軍,曹暢.玻璃容器法測定大鼠足趾炎性腫脹[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2003(1):124.

[8]劉媛,周勁松,陳玉俊,等.白芍提取工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(7):1239-1240.

[9]徐叔云.藥理實驗方法學[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:713-749.

[10]張荒生,王進軍.痹痛定膠囊對大鼠佐劑性關節(jié)炎病變的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥,2008(8):38-40.