17種中藥活性成分對犬馬拉色菌體外藥敏試驗

張志宏,孫 博,金藝鵬,林德貴

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193)

馬拉色菌屬為人類及溫血動物體表正常菌群之一,也是條件致病菌。該菌分為7種,對于人類來說糠秕馬拉色是花斑癬、脂溢性皮炎的主要病原。犬馬拉色菌性外耳炎是犬臨床常見的一種外耳道疾病,由于犬外耳道的特殊構造、耳毛多、外耳道耵聹腺、脂肪腺分泌的異常,加之內(nèi)外環(huán)境的改變而使原本是常駐菌的馬拉色菌發(fā)生過度生長,造成馬拉色菌性外耳炎。從上世紀起,抑制馬拉色菌的藥物研究主要是以抗真菌劑如酮康唑、氟康唑為主。中藥以其不易產(chǎn)生耐藥性、低毒低副作用的特點越來越引起各國真菌學者的重視。本試驗選取17種具有明顯抑制真菌作用的中藥的活性成分對犬外耳炎分離的4種馬拉色菌進行體外藥敏試驗,同時以臨床常用抗真菌藥氟康唑做為對照,觀察抑菌效果,篩選出效果較好的中藥活性成分,為馬拉色菌相關疾病藥物治療提供新幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株 北京觀賞動物醫(yī)院2007年1～12月的犬外耳炎化驗中,在Leeming&Notman培養(yǎng)基初步分離出馬拉色菌,又經(jīng)過SDA生長試驗、過氧化氫酶試驗、七葉苷利用試驗以及在不同吐溫上的生長試驗,最終鑒定出4個馬拉色菌菌種,其中厚皮馬拉色菌16株,合軸馬拉色菌11株,限制馬拉色菌3株,鈍形馬拉色菌2株。

1.2 供試藥物 肉桂醛、檸檬醛、土槿皮乙酸、厚樸酚、麝香草酚、鹽酸小檗堿、丁香酚、大黃酚、肉桂酸、丹皮酚、丹參酮 II、黃芩苷、白藜蘆醇、莪術醇、兒茶素、苦參堿、酮康唑、氟康唑、鹽酸特比萘芬等標準品均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 方法 本試驗參照美國臨床和實驗室標準委員會(CLSI)制定的M-27A標準進行微量液基稀釋法藥敏試驗。

1.3.1 Leeming&Notman液體培養(yǎng)基制備 蛋白胨1.0 g,葡萄糖1.0 g,牛膽鹽 8.0 g,酵母浸膏2.0 g,甘油 1.0 g,吐溫-605.0 g,橄欖油 30mL,氯霉素50 mg,加入1000mL蒸餾水混勻,115℃高壓滅菌15 min,備用。

1.3.2 菌液制備 取馬拉色菌于試驗前35℃培養(yǎng)24 h活化,活化2次,使之處于指數(shù)生長期后期,挑取少量菌落稀釋于滅菌生理鹽水中,血細胞計數(shù)板計數(shù)調整濃度為1×104～5×104CFU/mL,再用Leeming&Notman液體培養(yǎng)基調整至2.5×103±1.0×103CFU/mL。

1.3.3 藥液及藥敏板配制 將17種中藥活性成分和氟康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬精確稱量后用二甲基亞砜(DMSO)溶解成1×105μg/mL原液備用。96孔細胞培養(yǎng)板,于每排1～11孔分別加入Leeming&Notman液體培養(yǎng)基100μL。原藥用培養(yǎng)基稀釋100倍于第一孔加入100μL,2～10孔依次倍比稀釋。1～11孔加菌懸液100μL,11號孔不加藥液作為生長對照,12孔加入Leeming&Notman液體培養(yǎng)基200μL作為空白對照。每株菌每種藥物3組平行對照。藥敏試驗共重復2次。

2 試驗結果

MIC值判定:32℃孵育每隔24 h觀察記錄結果連續(xù)觀察7 d,肉眼觀察與生長對照孔相比明顯減少為MIC值。17種中藥活性成分對馬拉色菌藥敏試驗結果見表1。

3 討論

近年來對中藥抗真菌方面的研究和報道逐漸增多,國內(nèi)外對這一課題的重視程度也在與日俱增。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中,很早就有關于應用天然藥物及其提取物治療癬證的記錄。本研究根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學臨床應用實踐及文獻記載選取了17種具有抗真菌活性的天然藥物的活性成分針對馬拉色菌進行體外藥敏試驗,尋找效果明顯物質為臨床用藥及進一步深入研究提供參考。

本試驗對從患外耳炎犬耳道中分離出的馬拉色菌進行研究,結果表明,這17種中藥活性成分中,對馬拉色菌具較強抑制作用的有肉桂醛、檸檬醛和丁香酚。其中尤以肉桂醛抑菌效果最好,但其效果稍遜于酮康唑、氟康唑。由于氟康唑、酮康唑等對馬拉色菌僅有抑制作用,極易產(chǎn)生耐藥性而失去治療作用。而肉桂醛等中藥活性成分不易產(chǎn)生耐藥性,且對馬拉色菌有殺滅作用,因此其應用前景十分樂觀。有報道稱鹽酸特比萘芬對皮膚癬菌殺菌力強[2],本試驗結果顯示其抗馬拉色菌的效果一般。而各藥物對分離出的4種馬拉色菌的藥敏結果并無顯著差異。

表1 17種中藥活性成分對馬拉色菌藥敏試驗結果(微量液基稀釋法)

土槿皮乙酸、麝香草酚、苦參堿、兒茶素、莪術醇、膽苦苷、丹皮酚、丹參酮Ⅱ 、大黃酚、白藜蘆醇、黃芩苷、肉桂酸對馬拉色菌無明顯抑制作用。雖然這些中藥單體均有文獻記載具有抗真菌作用,但本試驗中它們的活性成分對馬拉色菌的作用效果并不明顯。筆者認為其原因可能是由于馬拉色菌與其他真菌的種屬差異有關。另外藥物活性成分與有效成分的差別及中藥本身成分的復雜性也是重要的影響因素。

念珠菌對唑類藥物有拖尾現(xiàn)象,結果不易判讀;而馬拉色菌藥敏試驗無明顯的拖尾現(xiàn)象,結果容易判讀。目前,對于馬拉色菌體外藥敏試驗還沒有標準化方案,特別是中藥抗馬拉色菌的藥敏試驗的標準方案和參考標準目前仍是空白。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn),將CLSI制定的M-27A標準運用到中藥活性成分抗馬拉色菌試驗中,同樣具有試驗結果易分析、方便、可重復性好等優(yōu)點,這將有利于抗真菌中藥藥敏試驗標準化,推動中藥抗真菌作用研究。

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