結核桿菌多位點環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立

王正榮，陳創(chuàng)夫,*，楊明鋒，孟 茹，曹旭東，張 輝，喬 軍

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832003；2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆石河子832003)

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性疾病，能夠感染人和多種哺乳動物以及禽類，其中導致人類感染的結核菌大多數(shù)是人結核分枝桿菌，也有10%以上是由牛分枝桿菌引起的[2]。結核分枝桿菌的培養(yǎng)周期較長，使用羅氏培養(yǎng)基進行細菌分離鑒定周期長達1～2個月[3]，不利于結核分枝桿菌的快速檢測。20世紀90年代以來，分子生物學檢測技術快速發(fā)展，各種新的基因檢測技術不斷出現(xiàn)[4-6]。由于目前基因檢測技術的復雜性和結核分枝桿菌的高傳染性，要進行結核分枝桿菌的基因檢測，不僅需要昂貴的儀器設備，而且對實驗室條件也有很高的要求[7]，這給結核病的快速診斷造成許多困難。環(huán)介導等溫基因擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的DNA擴增方法[8]，具有簡單、快速、特異性強的特點。為此,本實驗采用LAMP法對痰樣本中的結核分枝桿菌進行檢測，并對該方法的靈敏性、特異性以及從痰樣中區(qū)分致病性結核分枝桿菌和非致病性結核分枝桿菌，鑒別診斷結核分支桿菌和牛分枝桿菌的準確性做了評估。

1 材料和方法

1.1 菌株及主要儀器和試劑 結核分枝桿菌標準株H37Rv(Mycobacterium tuberculosis，H37Rv)、結核分枝桿菌弱毒株H37Ra(M.tuberculosis，H37Ra)、卡介苗BCG、龜分枝桿菌(M.chelonae)，均為本實驗室保存，牛分枝桿菌(M.bovis，C68003)、牛分枝桿菌(M.bovis，C68014)、禽分枝桿菌(M.anvim，C68223)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。HW-8C型微量恒溫器購自紹興衛(wèi)星醫(yī)療設備公司；BstDNA聚合酶購自NEB公司，SYRB-GREENⅠ購自北京鼎國生物技術有限責任公司；100 bp DNA Ladder購自AXCENGE公司，Taq酶購自天根生化科技有限公司；呼吸道樣本DNA提取試劑盒購自Roche Diagnostics GmbH公司；限制性內(nèi)切酶PstⅠ、SphⅠ、EcoRⅠ均購自TaKaRa公司。

1.2 引物設計 根據(jù)大多數(shù)致病性結核分枝桿菌共有序列esat-6(NP3849089)，結核分枝桿菌(NP 214519)和牛分枝桿菌(NP853675)gyrB共有特征性序列，以及結核分枝桿菌種特異序列mtp40(NP69737)，使用Primer ExplorerⅣ軟件設計6對特征性引物，引物由上海生工合成(表1)。

1.3 檢測樣品DNA的提取 采用口腔拭子DNA提取試劑盒提取60份來自60個結核病人的痰樣基因組；同時，將痰樣接種羅氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取各標準菌株基因組DNA。

1.4 LAMP檢測方法的建立 25 μL LAMP反應體系：FIP和 BIP各 0.8 μmol/L，F(xiàn)3和 B3各0.2 μmol/L、1.6 mmol/L dNTPs、6.0 mmol/L MgSO4、1 M Betaine、10×BstDNA Polymerase Buffer 2.5 μL、BstDNA 聚合酶8 u，加ddH2O至25 μL，移至制備好的模板中混勻。反應條件：63.5℃反應50 min，85℃2 min終止反應。每管加入100×SYBR GreenⅠ1 μL，呈綠色為陽性，棕色為陰性；取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，LAMP產(chǎn)物的電泳圖呈特征性梯狀條帶。

表1 LAMP擴增所需引物和序列位置Table 1 The primer and the site of sequence for LAMP

1.5 LAMP擴增反應的特異性、敏感性和準確性的檢測

1.5.1 LAMP擴增反應特異性、敏感性的檢測 分別以人結核分枝桿菌標準株H37Rv、弱毒株H37Ra、卡介苗BCG、牛分支桿菌、龜分枝桿菌、禽分枝桿菌基因組為模板對建立的LAMP方法的特異性進行檢測。以本實驗室構建的esat-6重組質粒為模板，并對其進行稀釋：100～1010，測出相應的OD值，換算各濃度稀釋液中質粒的拷貝數(shù)，然后進行LAMP檢測，確定該檢測方法能檢測到的最低濃度，進行3次重復試驗。

1.5.2 臨床樣本符合率檢測 從某醫(yī)院傳染科收集60份痰液樣本(含非結核病患者痰液及結核病患者痰液，使用酸性羅氏培養(yǎng)法進行鑒定)，痰標本加入3倍～5倍體積分數(shù)為2%N-acety-L-cysteine-NaOH，振蕩混勻孵育15 min，加入0.067 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)至總體積40 mL，以3 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀。使用呼吸道樣本DNA提取試劑盒提取痰液中的DNA。DNA提取物分別用于PCR驗證及LAMP法檢測。同時將痰樣接種酸性羅氏鑒別培養(yǎng)基。

1.6 LAMP擴增產(chǎn)物的酶切鑒定 實驗選用PstⅠ、SphⅠ、EcoRⅠ3種限制性內(nèi)切酶，分別對esat-6、gyrB、mtp40基因的LAMP擴增產(chǎn)物進行酶切鑒定。

2 結 果

2.1 引物特異性的檢測 分別以結核分枝桿菌標準株H37Rv、結核分枝桿菌弱毒株H37Ra、BCG、牛分枝桿菌(C68003)、牛分枝桿菌(C68014)、禽分枝桿菌桿菌、龜分枝桿菌基因組DNA為模板，對LAMP方法的特異性進行檢測。結果顯示，3組引物均具有很高的特異性(表2)，陽性擴增反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，均出現(xiàn)了預期的階梯式條帶(圖1-1、圖2和圖3)；同時對LAMP擴增產(chǎn)物進行了SYRB-GreenⅠ染色，陽性擴增反應產(chǎn)物均由橙色變?yōu)榫G色，陰性反應產(chǎn)物均仍為橙色(圖1-2)。

表2 esat-6、gyrB、mtp40引物特異性的檢測Table 2 Specificity test of theesat-6,gyrBandmtp40

2.2 LAMP擴增反應的靈敏度檢測 采用LAMP進行檢測時，質粒濃度稀釋倍數(shù)為107的模板仍可以擴增得到階梯式的目標條帶，而常規(guī)PCR在質粒稀釋倍數(shù)為105僅隱約觀察到條帶，比LAMP低了兩個稀釋度。根據(jù)2.6中不同濃度的質粒的OD值換算質粒數(shù)，對不同稀釋濃度的質粒數(shù)取平均值，結果表明3個重復實驗的最大數(shù)值為7拷貝/反應，因此可以估算本實驗建立的檢測痰樣本結核分枝桿菌LAMP方法可以檢測到7拷貝/反應(圖4)。

2.3 LAMP擴增反應臨床樣本符合率的檢測 結果如表3所示，細菌分離培養(yǎng)陽性為20份，陰性為40份；常規(guī)PCR檢測陽性為22份，而且均為結核分枝桿菌，陰性為38份；LAMP檢測陽性為22份，均為結核分枝桿菌，陰性為38份。經(jīng)分析，LAMP檢測方法與細菌培養(yǎng)的符合率為90.91%，與常規(guī)PCR檢測結果的符合率為100%。

表3 LAMP擴增反應臨床樣本符合率的檢測結果Table 3 Coincidence test of LAMP in clinical samples

2.4 LAMP擴增產(chǎn)物的酶切鑒定 為了驗證LAMP擴增產(chǎn)物，實驗中采用3種限制性內(nèi)切酶，分別為PstⅠ(可消化esat-6，得到146 bp和66 bp的片段)，SphⅠ(可消化gyrB，得到111 bp和74 bp的片段)，EcoRⅠ(可消化mtp40，得到 140 bp和 66 bp的片段)(圖 5)。

3 討 論

近20年來，在世界范圍內(nèi)結核病的發(fā)病率出現(xiàn)了回升的趨勢，如不采取強有力的措施，將造成更為嚴重的流行和威脅[9]。涂片鏡檢和分離培養(yǎng)是結核桿菌最常用的檢測方法。然而，涂片鏡檢的敏感性較低，需每毫升標本中至少有104個～105個結核分枝桿菌，分離培養(yǎng)至少每毫升標本中有103個～104個結核分枝桿菌才可檢出，而且涂片鏡檢不能區(qū)別結核分枝桿菌和非典型分枝桿菌。分離培養(yǎng)至少4周～6周才可培養(yǎng)出結核分枝桿菌。特別是微量菌、細胞壁缺陷菌和化療后細菌受到損傷培養(yǎng)難以生長，就更突出了培養(yǎng)的局限性。LAMP是對靶基因的6個特異部位設定4種引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增的一種新型的核酸擴增技術[8]。該技術只需一恒定溫度就能完成擴增反應，不需要特殊試劑和儀器設備，不需要預先進行雙鏈DNA的變性，并且擴增結果可通過加入熒光染料SYRB-GreenⅠ直觀的判斷，大大提高了其可操作性。本實驗篩選了3個基因建立多位點環(huán)介導等溫擴增的方法(1)大多數(shù)致病性結核桿菌所共有的基因esat-6[10-11]，該基因可有效鑒別診斷致病性結核分枝桿菌和非致病結核分枝桿菌，亦可區(qū)分卡介苗免疫和自然感染；(2)gyrB基因為結核分支桿菌、牛分枝桿菌、禽分枝桿菌所共有[12]，而且前兩者的同源性達到99.9%，前兩者與后者的同源性分別為81.1%和81.3%，本實驗選取結核分枝桿菌、牛分枝桿菌與禽分枝桿菌的300 bp的差異序列，設計引物并進行LAMP檢測，可將禽分枝桿菌與結核分枝桿菌和牛分枝桿菌區(qū)分開；(3)mtp40基因為結核分枝桿菌的種特異性基因[13]，可準確的診斷結核分枝桿菌，為流行病調(diào)查提供依據(jù)，并可指導臨床用藥。

研究結果表明，實驗建立的LAMP診斷方法不僅具有很高的特異性，可區(qū)分致病性結核分枝桿菌和非致病性結核分枝桿菌，鑒別診斷自然感染和人工免疫，亦可準確判定結核分枝桿菌和牛分枝桿菌，并在60 min內(nèi)獲得結果。有研究表明，如果再加一對環(huán)狀引物，可將反應時間縮短一半[14]，但本實驗所選基因片段并不適合設計環(huán)狀引物，所以未作檢測。在靈敏度方面，實驗建立LAMP診斷方法可檢測到7個質?？截?反應，比常規(guī)PCR高100倍。有研究表明如果將反應時間縮短到35 min，雖然會降低檢測的靈敏度，但仍可鑒定固體培養(yǎng)基上的分枝桿菌[12]。在準確性方面，實驗將LAMP檢測結果與分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)結果以及常規(guī)PCR檢測結果做了對比。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測結果與鑒別培養(yǎng)結果的符合率為90.91%，與PCR檢測結果的符合率為100%，造成這種結果的可能原因是細菌培養(yǎng)檢測的靈敏性較低，當每毫升痰液中的含菌量少于103個～104個時分離不到結核分枝桿菌。

總之，LAMP是一種快速、高特異、高靈敏度的新型核酸檢測技術。由于其不需要復雜的儀器設備，而且可通過肉眼可視的方式快速判斷檢測結果，很適合在基層廣泛推廣應用。

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