高血壓病和2型糖尿病患者血清損傷ECV－304細(xì)胞的比較研究*

周永紅， 陳利國(guó)△， 屈 援， 唐海蘭， 程少冰

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，2管理學(xué)院，3實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，廣東 廣州 510632)

中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，高血壓病和2型糖尿病中均表現(xiàn)出血瘀證［1－4］的證候，說(shuō)明在臨床上存在“異病同證”，但其病理生理基礎(chǔ)尚需進(jìn)一步研究。體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)重要器官血管內(nèi)皮的功能有相似性［5］，本研究在前期建立2型糖尿病血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上［3］，進(jìn)一步觀察高血壓病和2型糖尿病血瘀證患者血清損傷ECV－304細(xì)胞后造成的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)分泌功能、細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度和骨架微絲分布的變化，對(duì)比不同疾病的血瘀證細(xì)胞損傷模型的差異，以探討中醫(yī)“異病同證”的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，為血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)研究提供相關(guān)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源 ECV－304細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 病人資料 (1)2型糖尿病血瘀證組:選取2005年9月－2006年8月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科、中醫(yī)科和神經(jīng)內(nèi)科住院的患者40例，符合WHO1999年［6］和 ADA2003年“2型糖尿病”診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］和1986年修訂的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。平均年齡(68.4±7.3)歲。(2)高血壓病血瘀證組:為同期暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管科、中醫(yī)科和神經(jīng)內(nèi)科就診及健康體檢的老年新近診斷為高血壓病(1－2級(jí))且未使用降壓藥物的病例的患者40例，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)JNC7指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)(收縮壓≥140 mmHg且舒張壓 ＜ 90 mmHg)［9］和血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。其中，按血壓級(jí)別分為:1級(jí)高血壓患者8例，2級(jí)高血壓患者32例，平均年齡(70.7±4.1)歲。所選病例能較好地代表血瘀證的各種兼證的臨床分布情況。2組患者均排除心、腦、腎等并發(fā)癥，2組患者的性別分布和平均年齡無(wú)顯著差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.3 血清制備收集 空腹取血，自凝后4℃、2000 r/min離心15 min，取上清液置無(wú)菌EP管中，56℃滅活30 min，－20℃凍存，備用。

1.4 試劑 胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所。DMEM培養(yǎng)基、Triton X－100和牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Gibco。內(nèi)皮素(endothelin，ET)放免試劑盒購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C，EPCR)、血管性假性血友病因子(von Willabrand factor，vWF)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，sTM)酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自ADL。Fluo－3/AM購(gòu)自Bio－Rad。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Rhodamine phalloidin)購(gòu)自 Invitiogen(300 U，貨號(hào) R415)。Hoechst 33258購(gòu)自華美生物工程公司。Phtri皿為Corning。激光共聚焦顯微鏡為Carl Zeiss。

2 方法

2.1 MTT法觀察細(xì)胞活性［10］將內(nèi)皮細(xì)胞以5×107cells/L的濃度種入96孔培養(yǎng)板，進(jìn)行分組干預(yù)。糖尿病血瘀證組加入10%濃度的糖尿病血瘀證患者血清，高血壓病血瘀證組加入10%濃度的高血壓病血瘀證患者血清，對(duì)照組則加入等量的DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。終止干預(yù)后予PBS洗去培液，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h，傾去上清液，加 DMSO 150 μL，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度值。

2.2 光鏡和電鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 按照1×108cells/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL細(xì)胞懸液。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h后，觀察大部分細(xì)胞相互融合形成單層，細(xì)胞呈現(xiàn)卵石狀排列，棄培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓，24 h后換新培養(yǎng)液，血清干預(yù)方法同前。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

按照2×107cells/L的密度將細(xì)胞種植在6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片上，干預(yù)方案同前，經(jīng)過(guò)固定、洗滌、脫水、加乙酸異戊酯和CO2臨界點(diǎn)干燥等程序后，掃描電鏡下觀察和拍片。

按照1×108cells/L的密度將細(xì)胞接種在25 mL培養(yǎng)瓶中，干預(yù)方案同前，經(jīng)過(guò)固定、漂洗、梯度脫水、滲透和包埋、固化、超薄切片和染色等程序后，透射電鏡下觀察和拍片。

2.3 各組血清對(duì)細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響 NO檢測(cè)利用硝酸還原酶法，ET檢測(cè)利用非平衡法，EPCR檢測(cè)、vWF檢測(cè)和sTM檢測(cè)均采用ELISA法，于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的A值，以A值為自變量(Y)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為因變量(X)，通過(guò)曲線擬合的方法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.4 共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度 按照1×108cells/L將細(xì)胞種植在Petri皿中，干預(yù)方法同前;終止干預(yù)后予PBS沖洗2次，10 μmol/L Fluo－3/AM加于Petri皿，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min;取出Petri皿，用PBS沖洗后置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。Fluo－3/AM的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，Kd值(熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù))在(0.37－2.30)×10－6之間。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。

2.5 熒光探針標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法觀察細(xì)胞骨架微絲 按照1×108cells/L將細(xì)胞種植在6孔培養(yǎng)板的蓋玻片上，干預(yù)方法同前;終止干預(yù)后37℃的PBS清洗細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次后滴加0.1%Triton X－100放置5 min，PBS清洗后用5%BSA孵育細(xì)胞30 min，加入熒光探針標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色，避光室溫放置2 h，PBS清洗細(xì)胞后滴加1%Hoechst，避光室溫放置10 min，PBS清洗細(xì)胞后緩沖甘油封片，－20℃冰箱凍存。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 血清損傷后細(xì)胞活性變化結(jié)果

MTT結(jié)果顯示:10%血清作用下，高血壓病血瘀證組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組的細(xì)胞活力也低于對(duì)照組(P＜0.05)，但高血壓病血瘀證組的細(xì)胞活力與糖尿病血瘀證組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組血清對(duì)細(xì)胞活性的影響Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

表1 各組血清對(duì)細(xì)胞活性的影響Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

*P ＜0.05 vs control.

Control 1.51 ±0.16 sera from patients with T2DM 0.88 ±0.11*sera from patients with hypertension 0.98 ±0.12*

2 血清損傷后細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察空白對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)典型血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài);糖尿病血瘀證組中細(xì)胞間隙增寬，部分輪廓不清，碎片較多;高血壓病血瘀證組形態(tài)與糖尿病血瘀證組類似，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Morphology of ECV －304 cells under inverted phase contrast microscope(×200).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖1 倒置相差顯微鏡下各組細(xì)胞的形態(tài)

掃描電鏡下觀察空白對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形，細(xì)胞表面有絲狀突起;糖尿病血瘀證組細(xì)胞明顯變形，有的收縮分離成為放射星狀體，表面有大小不一的圓形凹陷或突起;高血壓病血瘀證組細(xì)胞變形，有的細(xì)胞之間有指狀突起相連接，表面有大小不一的圓形凹陷或突起，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Morphology of ECV －304 cells under scanning electron microscope(×5000).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖2 掃描電鏡下各組細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察空白對(duì)照組細(xì)胞表面微絨毛豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體雙層膜及內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰，核形態(tài)為圓形，見(jiàn)核仁;糖尿病血瘀證組細(xì)胞表面有少量微絨毛，胞漿內(nèi)吞飲泡較多，大小不一。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少并擴(kuò)張，核糖體部分丟失。平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈現(xiàn)空泡狀，線粒體模糊不清，嵴消失，核未見(jiàn)特殊改變;高血壓病血瘀證組細(xì)胞形態(tài)與糖尿病血瘀證組類似，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Morphology of ECV－304 cells under transmission electron microscope.A:control(×30000);B:sera from patients with T2DM(×24000);C:sera from patients with hypertension(×15000).圖3 透射電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

3 血清損傷后細(xì)胞內(nèi)分泌功能變化

高血壓病血瘀證組的ET水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也高于對(duì)照組(P﹤0.05)，且高血壓病血瘀證組的ET水平低于糖尿病血瘀證組(P＜0.05);高血壓病血瘀證組的NO水平低于對(duì)照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也低于對(duì)照組(P＜0.05)，且高血壓病血瘀證組的NO水平高于糖尿病血瘀證組(P＜0.05)，高血壓病血瘀證組的EPCR、vWF和sTM含量高于對(duì)照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也高于對(duì)照組(P＜0.05)，且高血壓病血瘀證組的EPCR水平低于糖尿病血瘀證組(P＜0.05)，而高血壓病血瘀證組的vWF和sTM含量與糖尿病血瘀證組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。以上均見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞內(nèi)分泌功能變化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

表2 各組細(xì)胞內(nèi)分泌功能變化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs sera from patients with T2DM.T2DM:type 2 diabetes mellitus.

Group ET(nmol/L) NO(μmol/L) EPCR(mg/L) vWF(%) sTM(μmol/L)Control 77.88 ±10.07 52.97 ±8.51 113.94 ±16.04 51.09 ±9.92 18.47 ±2.59 Sera from patients with T2DM 286.03 ±24.03* 22.37 ±3.30* 189.66 ±11.76* 79.94 ±8.52* 29.25 ±5.16*Sera from patients with hypertension 177.62 ±15.77*# 32.61 ±6.76*#168.32 ±21.94*#80.17 ±10.25* 28.36 ±4.94*

4 血清損傷后對(duì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響

高血壓病血瘀證組［Ca2+］i高于對(duì)照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組［Ca2+］i高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表3。高血壓病血瘀證組［Ca2+］i高于糖尿病血瘀證組(P＜0.05);表現(xiàn)在胞漿中的熒光分布不均勻，呈網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Changes in［Ca2+］iof ECV －304 cells under laser scanning confocal microscope(×600).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖4 激光共聚焦顯微鏡下各組細(xì)胞的［Ca2+］i熒光圖像

表3 各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度比較Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

表3 各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度比較Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

＊P＜0.05 vs sera from patients with T2DM.

Group ［Ca2+］i(fluorescence intensity)Control 92.05 ±6.42 Sera from patients with T2DM 127.53 ±10.48*Sera from patients with hypertension 156.78 ±8.22*

5 血清損傷后對(duì)細(xì)胞骨架微絲的影響

對(duì)照組細(xì)胞骨架微絲分布規(guī)則，彼此連接，附著在細(xì)胞內(nèi)特定部位，呈絲網(wǎng)狀有序排列;糖尿病血瘀證組可見(jiàn)細(xì)胞外形皺縮，間隙加大，微絲斷裂，排列紊亂，少部分區(qū)域缺失，微絲收縮變短或移向周邊，絲網(wǎng)狀有序排列消失;高血壓病血瘀證組可見(jiàn)細(xì)胞間隙加大，微絲全部斷裂，排列紊亂，大部分微絲收縮成團(tuán)，少部分微絲缺失出現(xiàn)空隙，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Cytoskeleton of ECV－304 cells under laser scanning confocal microscope(×400).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖5 激光共聚焦顯微鏡下各組細(xì)胞的骨架微絲分布

討 論

證候模型是中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究的重要工具，利用證候模型來(lái)研究中醫(yī)基礎(chǔ)理論及臨床療效，可以為中醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)［11］。我們?cè)谇捌诮⑻悄虿⊙鲎C血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上［3］，針對(duì)高血壓病血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和糖尿病血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型進(jìn)行比較研究，以明確在特定環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的共同變化機(jī)制。因此我們應(yīng)用前期較為成熟的技術(shù)如血管損傷標(biāo)志物、胞內(nèi)游離鈣濃度和細(xì)胞骨架微絲來(lái)揭示異病同證的共性，尋找出血瘀證中某些具有普遍意義的最基本的客觀指標(biāo)，為病證結(jié)合細(xì)胞模型的深入研究提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)中我們觀察到高血壓病血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型和2型糖尿病血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型都存在不同程度的內(nèi)皮功能障礙，與人體中內(nèi)皮細(xì)胞所處的解剖部位是一個(gè)易損傷的功能性界面有關(guān)，各種損傷刺激和心血管危險(xiǎn)因素都首先作用于此，導(dǎo)致功能的降低和紊亂［12］。正是由于出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙的作用機(jī)制有相同之處，表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)分泌功能(vWF和TM)等方面沒(méi)有明顯的差異，此為“證”同，可以作為“血瘀證”共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)模型。而在異“病”方面，由于糖尿病和高血壓病的發(fā)病機(jī)制不同，臨床表現(xiàn)各異，尤其高血壓病涉及到血脂異常，服用藥物等因素，所以二者的血清也在不同程度上存在差異，因而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的程度也不同，例如細(xì)胞內(nèi)分泌功能(EPCR、ET和NO)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度等，此一點(diǎn)有可能作為“病”異的基礎(chǔ)，前后結(jié)合后則明確體現(xiàn)了異“病”同“證”的特點(diǎn)，深入機(jī)制探討將有可能對(duì)血瘀證的微觀辨證提供依據(jù)。

另外，我們?cè)谝酝难芯吭?jīng)討論過(guò)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高可能介導(dǎo)了血瘀證血清對(duì)細(xì)胞骨架的損傷作用［13］。此次的研究中也證實(shí)了這點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高的高血壓病血瘀證組在細(xì)胞骨架微絲的分布上與空白對(duì)照組差異最大，此一點(diǎn)也可以解釋“異病同證”的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型在細(xì)胞骨架微絲上的差異。

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