潘 喆, 李曉博, 孫愛麗, 莊向華, 姜冬青, 劉元濤△, 姜兆順
(1山東大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東 濟(jì)南 250033;2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東 濟(jì)南 250031)
瘦素是肥胖基因(ob)的產(chǎn)物,主要由白色脂肪組織合成,其主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合,影響神經(jīng)肽Y等多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌,導(dǎo)致攝食減少、耗能增加[1]。除了腦組織外,目前研究表明,肝臟、骨骼肌、心肌、腎臟等外周組織也存在瘦素受體[2,3],提示瘦素可通過中樞及外周雙重作用調(diào)節(jié)機(jī)體的各種功能。心臟是瘦素的重要靶器官之一。研究發(fā)現(xiàn),瘦素信號缺陷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加,并且與慢性心衰的發(fā)生有密切關(guān)系,但確切機(jī)制尚不清楚[4]。自由基損傷是各種因素導(dǎo)致心肌損傷的共同機(jī)制之一,本文將通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng),觀察瘦素對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響并初步探討其作用機(jī)制。
Caspase-3單克隆抗體(識別全長及裂解的大片段)、磷酸化胞外信號調(diào)控激酶ERK1/2單克隆抗體(phos-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)(Cell Signaling Technology)。ERK1/2抗體(Pan-ERK)、辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(Santa Cruz),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco),細(xì)胞培養(yǎng)皿(BD),TUNEL 試劑盒(Roche),瘦素(Calbiochem),PD98059(Cell Signaling Technology),DAPI封片劑(Vector Laboratories),其它材料來自Sigma。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心室肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞,培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,培養(yǎng)溫度為37℃、飽和濕度和5%CO2。實驗前,細(xì)胞于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至亞融合狀態(tài),然后無血清培養(yǎng)4 h。為誘導(dǎo)凋亡,細(xì)胞分為:對照組、H2O2處理組、H2O2+瘦素組。H2O2終濃度400 μmol/L,處理時間為6 h。瘦素濃度為6 nmol/L(此濃度參考相關(guān)文獻(xiàn),在生理濃度范圍內(nèi))預(yù)處理1 h并維持到 H2O2處理結(jié)束。PD98059抑制實驗,細(xì)胞分為:對照組、H2O2處理組、PD98059+H2O2組、PD98059+H2O2+瘦素組。細(xì)胞應(yīng)用瘦素前,先用50 μmol/L PD98059預(yù)處理15 min。
2.2 細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL試劑盒檢測。細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗,4℃條件下用4%甲醛固定15 min。PBS沖洗后,加2%Triton(溶于0.1%枸櫞酸鈉),孵育5 min。TUNEL溶液室溫染色1 h,PBS沖洗后直接用含DAPI的封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并計算凋亡細(xì)胞陽性率。
2.3 Caspase-3、ERK1/2蛋白表達(dá)及活性測定采用Western blotting方法。細(xì)胞經(jīng)處理后,用PBS沖洗2遍,冰上裂解(裂解液:20 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L Na3VO4,25 mmol/L/L NaF,25 mmol/L β-glycerophosphate,2 mmol/L EDTA,2 mmol/L EGTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF,2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin,pH 7.5)。4℃條件下離心15 min(14000 r/min),取上清并測定蛋白濃度(Bradford法)。取20 μg蛋白上樣、跑膠(12%SDS)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,1%脫脂奶粉封閉1 h。Caspase-3、p-ERK、Pan-ERK1/2按1∶1000濃度雜交2 h。PBS充分洗膜后,1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗室溫雜交1 h。PBS洗膜,ECL顯色。Western blotting結(jié)果定量分析用 NIH ImageJ 1.42軟件進(jìn)行。
瘦素預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率(36.0% ±3.6%)較H2O2單純處理組(56.0% ±3.6%)顯著降低(P<0.05),見圖 1。
Figure 1.The effect of leptin on H2O2-induced apoptosis in H9c2 cells..n=3.▲▲P<0.01 vs H2O2group;#P <0.05 vs control.圖1 瘦素對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響的TUNEL染色分析
H2O2處理6 h,caspase-3活性明顯增加(蛋白裂解增加)。瘦素預(yù)處理1 h顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的caspase-3激活,見圖2。以 cleaved caspase-3與T-caspase-3灰度比值作為casepase-3激活的指標(biāo)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示:H2O2處理組caspase-3活性顯著高于對照組(P<0.01);瘦素預(yù)處理組caspase-3活性較單純H2O2處理組顯著降低(P<0.01),見圖3。
Figure 2.Effects of leptin on caspase-3 activation.圖2 瘦素對caspase-3活性的影響
Figure 3.Quantitative analysis of the effect of leptin on caspase-3 activation..n=3.#P<0.05,##P<0.01 vs control;▲▲P <0.01 vs H2O2+leptin group.圖3 瘦素對caspase-3活性影響的定量分析
H2O2處理15 min,可明顯抑制 ERK1(上帶)及ERK2(下帶)的活性(磷酸化);瘦素預(yù)處理1 h,明顯增加ERK1/2的基礎(chǔ)活性并部分阻斷H2O2誘導(dǎo)的ERK1/2活性下降,兩者對ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯作用,見圖4。以p-ERK1/2與 Pan-ERK1/2灰度比值作為ERK激活的指標(biāo)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示:瘦素處理組ERK活性顯著高于對照組(P<0.05);而H2O2處理組ERK活性較對照組顯著降低(P<0.01);瘦素預(yù)處理組ERK活性較單純H2O2處理組ERK活性顯著升高(P<0.05),見圖5。
Figure 4.Effects of leptin on ERK1/2 activation.圖4 瘦素對ERK1/2活性的影響
Figure 5.Quantitative analysis of the effect of leptin on ERK activation..n=3.#P<0.05,##P<0.01 vs control;▲P<0.05 vs H2O2group.圖5 瘦素對caspase-3活性影響的定量分析
PD98059+H2O2組細(xì)胞凋亡較單純H2O2處理組增加(57.2% ±3.2%vs 65.4% ±3.5%),但差異無顯著(P>0.05);PD98059+H2O2+瘦素組與PD98059+H2O2組比較,細(xì)胞凋亡率差異無顯著(60.8% ±4.0%vs 65.4% ±3.5%,P>0.05),見圖6。
Figure 6.Effect of MEK inhibitor PD98059 on the cytoprotective function of leptin..n=3.*P<0.05 vs control.圖6 MEK抑制劑PD98059對瘦素保護(hù)作用的影響
作為肥胖基因(ob)的產(chǎn)物,瘦素的主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合,控制進(jìn)食并增加熱量消耗來調(diào)節(jié)動物體重[1]。近來發(fā)現(xiàn),除了腦組織外,許多外周組織表達(dá)瘦素受體,其中心臟是瘦素作用的重要外周靶器官之一[5]。
體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),無論是缺乏瘦素的ob/ob小鼠還是瘦素受體存在缺陷的 db/db小鼠,兩者心肌細(xì)胞凋亡較正常小鼠明顯增加,而給予ob/ob小鼠補(bǔ)充外源性瘦素則明顯降低細(xì)胞凋亡率[4],提示瘦素對維持心肌細(xì)胞正常生存具有重要作用。在上述研究中,學(xué)者還發(fā)現(xiàn)ob/ob及db/db小鼠心肌細(xì)胞脂肪含量明顯增加,提示瘦素防止正常心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)脂肪代謝、防止脂類物質(zhì)的毒性作用而間接實現(xiàn)的。
自由基是各種誘因?qū)е滦募〖?xì)胞凋亡的共同機(jī)制之一。本文發(fā)現(xiàn),應(yīng)用 400 μmol/L H2O2處理H9c2細(xì)胞6 h,約56%細(xì)胞出現(xiàn)凋亡;而應(yīng)用生理劑量的瘦素預(yù)處理1 h,可使凋亡細(xì)胞比例顯著降低。本研究結(jié)果提示瘦素不但通過改善脂代謝防止心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而且還可能對凋亡信號具有直接抑制作用。為了探討瘦素的對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制,本研究觀察了其對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK活性的影響。ERK是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)MAPKs的一個亞家族。在哺乳動物體內(nèi)含有5種ERK,分別是ERK 1-5,最常見的ERK1/2的蛋白蘇氨酸及相鄰的酪氨酸殘基均在一個雙重特異性模序中分別由MEK1/2直接磷酸化[6,7]。有研究表明 ERK 對心肌缺血-再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[8]。
已知,瘦素與其受體結(jié)合可激活ERK,這在多種細(xì)胞中已得到證實[2]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2對 ERK活性的抑制作用,這可能是其造成細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一;而瘦素不但直接激活ERK1/2,而且部分降低了H2O2對ERK活性的抑制,提示瘦素對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與激活MAPK信號途徑有關(guān)。為了進(jìn)一步證實以上結(jié)論,本研究觀察了ERK激酶MEK抑制劑PD98059對瘦素作用的影響,結(jié)果顯示瘦素的保護(hù)作用可被PD98059所阻斷。關(guān)于MAPK抑制凋亡的機(jī)制,目前還不完全清楚。有研究認(rèn)為這可能與抑制促凋亡蛋白Bad的功能有關(guān)[9,10],詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
總之,本研究證實瘦素對自由基造成的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用,其機(jī)制可能與激活MAPK信號途徑有關(guān),但詳細(xì)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。值得注意的是,與本文所觀察的瘦素的對心肌細(xì)胞的直接效應(yīng)不同,有研究發(fā)現(xiàn)瘦素可增加交感神經(jīng)興奮性、誘導(dǎo)內(nèi)皮自由基產(chǎn)生、促進(jìn)血栓形成等機(jī)制,對心肌細(xì)胞具有間接的損傷作用[11]。如何有效利用瘦素的心肌保護(hù)作用,同時降低其對心肌的間接損害是未來臨床工作亟待解決的重要課題。
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