瘦素抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡

潘 喆， 李曉博， 孫愛麗， 莊向華， 姜冬青， 劉元濤△， 姜兆順

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250033;2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250031)

瘦素是肥胖基因(ob)的產(chǎn)物，主要由白色脂肪組織合成，其主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合，影響神經(jīng)肽Y等多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌，導(dǎo)致攝食減少、耗能增加［1］。除了腦組織外，目前研究表明，肝臟、骨骼肌、心肌、腎臟等外周組織也存在瘦素受體［2，3］，提示瘦素可通過中樞及外周雙重作用調(diào)節(jié)機(jī)體的各種功能。心臟是瘦素的重要靶器官之一。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素信號缺陷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，并且與慢性心衰的發(fā)生有密切關(guān)系，但確切機(jī)制尚不清楚［4］。自由基損傷是各種因素導(dǎo)致心肌損傷的共同機(jī)制之一，本文將通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，觀察瘦素對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響并初步探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

Caspase－3單克隆抗體(識別全長及裂解的大片段)、磷酸化胞外信號調(diào)控激酶ERK1/2單克隆抗體(phos－extracellular signal－regulated kinase，p－ERK)(Cell Signaling Technology)。ERK1/2抗體(Pan－ERK)、辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(Santa Cruz)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(BD)，TUNEL 試劑盒(Roche)，瘦素(Calbiochem)，PD98059(Cell Signaling Technology)，DAPI封片劑(Vector Laboratories)，其它材料來自Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心室肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為37℃、飽和濕度和5%CO2。實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，然后無血清培養(yǎng)4 h。為誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞分為:對照組、H2O2處理組、H2O2+瘦素組。H2O2終濃度400 μmol/L，處理時(shí)間為6 h。瘦素濃度為6 nmol/L(此濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)，在生理濃度范圍內(nèi))預(yù)處理1 h并維持到 H2O2處理結(jié)束。PD98059抑制實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞分為:對照組、H2O2處理組、PD98059+H2O2組、PD98059+H2O2+瘦素組。細(xì)胞應(yīng)用瘦素前，先用50 μmol/L PD98059預(yù)處理15 min。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測 采用TUNEL試劑盒檢測。細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗，4℃條件下用4%甲醛固定15 min。PBS沖洗后，加2%Triton(溶于0.1%枸櫞酸鈉)，孵育5 min。TUNEL溶液室溫染色1 h，PBS沖洗后直接用含DAPI的封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算凋亡細(xì)胞陽性率。

2.3 Caspase－3、ERK1/2蛋白表達(dá)及活性測定采用Western blotting方法。細(xì)胞經(jīng)處理后，用PBS沖洗2遍，冰上裂解(裂解液:20 mmol/L Tris－HCl，0.1 mmol/L Na3VO4，25 mmol/L/L NaF，25 mmol/L β－glycerophosphate，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，2 mg/L aprotinin，2 mg/L leupeptin，pH 7.5)。4℃條件下離心15 min(14000 r/min)，取上清并測定蛋白濃度(Bradford法)。取20 μg蛋白上樣、跑膠(12%SDS)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1%脫脂奶粉封閉1 h。Caspase－3、p－ERK、Pan－ERK1/2按1∶1000濃度雜交2 h。PBS充分洗膜后，1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗室溫雜交1 h。PBS洗膜，ECL顯色。Western blotting結(jié)果定量分析用 NIH ImageJ 1.42軟件進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 瘦素對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

瘦素預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率(36.0% ±3.6%)較H2O2單純處理組(56.0% ±3.6%)顯著降低(P＜0.05)，見圖 1。

Figure 1.The effect of leptin on H2O2－induced apoptosis in H9c2 cells..n=3.▲▲P＜0.01 vs H2O2group;#P ＜0.05 vs control.圖1 瘦素對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響的TUNEL染色分析

2 瘦素對caspase－3活性的影響

H2O2處理6 h，caspase－3活性明顯增加(蛋白裂解增加)。瘦素預(yù)處理1 h顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的caspase－3激活，見圖2。以 cleaved caspase－3與T－caspase－3灰度比值作為casepase－3激活的指標(biāo)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示:H2O2處理組caspase－3活性顯著高于對照組(P＜0.01);瘦素預(yù)處理組caspase－3活性較單純H2O2處理組顯著降低(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Effects of leptin on caspase－3 activation.圖2 瘦素對caspase－3活性的影響

Figure 3.Quantitative analysis of the effect of leptin on caspase－3 activation..n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;▲▲P ＜0.01 vs H2O2+leptin group.圖3 瘦素對caspase－3活性影響的定量分析

3 瘦素對ERK1/2活性的影響

H2O2處理15 min，可明顯抑制 ERK1(上帶)及ERK2(下帶)的活性(磷酸化);瘦素預(yù)處理1 h，明顯增加ERK1/2的基礎(chǔ)活性并部分阻斷H2O2誘導(dǎo)的ERK1/2活性下降，兩者對ERK1/2蛋白表達(dá)無明顯作用，見圖4。以p－ERK1/2與 Pan－ERK1/2灰度比值作為ERK激活的指標(biāo)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示:瘦素處理組ERK活性顯著高于對照組(P＜0.05);而H2O2處理組ERK活性較對照組顯著降低(P＜0.01);瘦素預(yù)處理組ERK活性較單純H2O2處理組ERK活性顯著升高(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Effects of leptin on ERK1/2 activation.圖4 瘦素對ERK1/2活性的影響

Figure 5.Quantitative analysis of the effect of leptin on ERK activation..n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;▲P＜0.05 vs H2O2group.圖5 瘦素對caspase－3活性影響的定量分析

4 MEK抑制劑PD98059對瘦素保護(hù)作用的影響

PD98059+H2O2組細(xì)胞凋亡較單純H2O2處理組增加(57.2% ±3.2%vs 65.4% ±3.5%)，但差異無顯著(P＞0.05);PD98059+H2O2+瘦素組與PD98059+H2O2組比較，細(xì)胞凋亡率差異無顯著(60.8% ±4.0%vs 65.4% ±3.5%，P＞0.05)，見圖6。

Figure 6.Effect of MEK inhibitor PD98059 on the cytoprotective function of leptin..n=3.*P＜0.05 vs control.圖6 MEK抑制劑PD98059對瘦素保護(hù)作用的影響

討 論

作為肥胖基因(ob)的產(chǎn)物，瘦素的主要功能是通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合，控制進(jìn)食并增加熱量消耗來調(diào)節(jié)動(dòng)物體重［1］。近來發(fā)現(xiàn)，除了腦組織外，許多外周組織表達(dá)瘦素受體，其中心臟是瘦素作用的重要外周靶器官之一［5］。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是缺乏瘦素的ob/ob小鼠還是瘦素受體存在缺陷的 db/db小鼠，兩者心肌細(xì)胞凋亡較正常小鼠明顯增加，而給予ob/ob小鼠補(bǔ)充外源性瘦素則明顯降低細(xì)胞凋亡率［4］，提示瘦素對維持心肌細(xì)胞正常生存具有重要作用。在上述研究中，學(xué)者還發(fā)現(xiàn)ob/ob及db/db小鼠心肌細(xì)胞脂肪含量明顯增加，提示瘦素防止正常心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)脂肪代謝、防止脂類物質(zhì)的毒性作用而間接實(shí)現(xiàn)的。

自由基是各種誘因?qū)е滦募〖?xì)胞凋亡的共同機(jī)制之一。本文發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 400 μmol/L H2O2處理H9c2細(xì)胞6 h，約56%細(xì)胞出現(xiàn)凋亡;而應(yīng)用生理劑量的瘦素預(yù)處理1 h，可使凋亡細(xì)胞比例顯著降低。本研究結(jié)果提示瘦素不但通過改善脂代謝防止心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而且還可能對凋亡信號具有直接抑制作用。為了探討瘦素的對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制，本研究觀察了其對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK活性的影響。ERK是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase)MAPKs的一個(gè)亞家族。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有5種ERK，分別是ERK 1－5，最常見的ERK1/2的蛋白蘇氨酸及相鄰的酪氨酸殘基均在一個(gè)雙重特異性模序中分別由MEK1/2直接磷酸化［6，7］。有研究表明 ERK 對心肌缺血－再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［8］。

已知，瘦素與其受體結(jié)合可激活ERK，這在多種細(xì)胞中已得到證實(shí)［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2對 ERK活性的抑制作用，這可能是其造成細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一;而瘦素不但直接激活ERK1/2，而且部分降低了H2O2對ERK活性的抑制，提示瘦素對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與激活MAPK信號途徑有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論，本研究觀察了ERK激酶MEK抑制劑PD98059對瘦素作用的影響，結(jié)果顯示瘦素的保護(hù)作用可被PD98059所阻斷。關(guān)于MAPK抑制凋亡的機(jī)制，目前還不完全清楚。有研究認(rèn)為這可能與抑制促凋亡蛋白Bad的功能有關(guān)［9，10］，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

總之，本研究證實(shí)瘦素對自由基造成的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其機(jī)制可能與激活MAPK信號途徑有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。值得注意的是，與本文所觀察的瘦素的對心肌細(xì)胞的直接效應(yīng)不同，有研究發(fā)現(xiàn)瘦素可增加交感神經(jīng)興奮性、誘導(dǎo)內(nèi)皮自由基產(chǎn)生、促進(jìn)血栓形成等機(jī)制，對心肌細(xì)胞具有間接的損傷作用［11］。如何有效利用瘦素的心肌保護(hù)作用，同時(shí)降低其對心肌的間接損害是未來臨床工作亟待解決的重要課題。

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