煙草PVY Real-Time PCR定量檢測體系的建立及應用

劉曉霞，楊金廣，王鳳龍*，錢玉梅，申莉莉，張 帥，王長栓，黃 瑾

(1.國家煙草專賣局煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京100081；3.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市分公司，廣西 百色 533000)

馬鈴薯Y病毒(PVY)是近年嚴重危害煙草生產(chǎn)的病毒之一，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。當前，檢測 PVY的方法主要集中于生物學鑒定、光鏡和電鏡觀察、免疫學方法、RT-PCR檢測技術(shù)、核酸雜交檢測技術(shù)等[2-3]，應用Real-time PCR技術(shù)對煙草PVY進行定量檢測報道較少。筆者應用 SYBR Green Real-time PCR技術(shù)，以煙草肌動蛋白基因為內(nèi)參，建立了煙草中 PVY的定量檢測方法，旨在為快速、靈敏、高效檢測 PVY含量提供有力的技術(shù)支持，同時也為煙草中其它病毒檢測技術(shù)的改進提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PVY毒源：純化的 PVY用接種緩沖液(0.01 mol/L PBS，PH7.0)研磨后，摩擦接種于枯斑三生煙(Nicotiana tabacumvar.samsun NN)，在防蟲溫室中培養(yǎng)，每月擴繁1次，以保持病毒侵染活性。

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)、RNAiso Plus 、Reverse Transcriptase M-ML(RNase H-)、Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、DL500 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。PVY DAS-ELISA檢測試劑盒購自ADGEN公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)PVY strain NTN isolate HR1全基因組序列(FJ204166)和actin基因(U60495)，按照標準熒光定量PCR引物設(shè)計原則，用Primer 5.0進行設(shè)計，然后通過Oligo 6.0軟件對所設(shè)計的引物進行評價，并通過在線BLSAT程序( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進行驗證，以避免引物序列與煙草基因組任何序列同源。引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。PVY 基因的上游引物為5’-TTCATCTCCATCCATCATAACC-3’，下游引物為5’-TACAACTTGCATACGACATAGG-3’，產(chǎn)物長度為 127 bp。Actin基因上游引物為5’-AAGGGATGCGAGGATGGA-3’，下游引物為5’-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3’，產(chǎn)物長度為105 bp。

1.3 方法

1.3.1 煙草總RNA的提取 利用RNAiso Plus進行煙草總RNA的提取，詳細方法參照試劑盒說明書。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄體系及條件 反轉(zhuǎn)錄體系和條件參照Reverse Transcriptase M-ML(RNase H-)的說明書，反應在東勝基因擴增儀上進行。

1.3.3 Real-time PCR反應體系及條件 參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)的說明書，反應體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各 0.5 μL ，cDNA 1 μL ，ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.5 μL，ddH2O 10 μL。

反應采用兩步法PCR反應的標準程序，并且制作融解曲線。反應程序設(shè)置為3個階段。預變性階段：95℃ 10 s；PCR 反應階段：95 ℃ 6 s，62 ℃ 35 s 重復35個循環(huán)；融解階段：95 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s。在 PCR 反應階段每個循環(huán)的延伸結(jié)束時收集熒光信號。

1.3.4 Real-time PCR標準曲線的制定和結(jié)果計算將PVY基因和actin基因的cDNA，采用5倍稀釋法稀釋成6個梯度，每個梯度設(shè)計3個重復，分別進行Real-time PCR反應，同時設(shè)立空白對照。利用 AB7500 Real-Time PCR system 自帶的SDS 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，生成標準曲線。根據(jù)標準曲線得到的線性公式，將樣品的 Ct值代入計算，經(jīng)過歸一化處理后得到PVY基因和actin基因的起始模板量，二者比值即為煙草中PVY基因的相對含量。

1.3.5 PVY Real-Time PCR定量檢測體系的應用2008年和2009年采自廣西百色呈典型煙草病毒病的樣品30個，分別用PVY DAS-ELISA檢測試劑盒(按照試劑盒操作說明進行，Thermo Multiskan spectrum測定)和Real-time PCR定量檢測體系檢測PVY，比較二者檢測結(jié)果。

取PVY病樣0.1 g，液氮研磨后平均分為兩份，用提取緩沖液(DAS-ELASA試劑盒中提供)和RNAiso Plus 以10倍稀釋法各稀釋成10個梯度，分別進行DAS-ELISA檢測和Real-time PCR檢測，比較二者的檢測稀釋極限。

2 結(jié) 果

2.1 PVY基因和actin基因的標準曲線

經(jīng)稀釋的系列 cDNA起始模板量和循環(huán)閾值Ct的線性關(guān)系曲線見圖1。PVY基因的標準曲線斜率和線性相關(guān)系數(shù)分別為-2.4447和 0.9960，actin基因的標準曲線斜率和線性相關(guān)系數(shù)分別為-2.4106和 0.9961，兩者的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明擴增效率高，可用于準確定量。

2.2 Real-time PCR定量檢測的準確性分析

PVY基因和actin基因在 AB7500 Real-Time PCR system進行擴增，分析后得到的擴增曲線和熔解曲線如圖2和圖3所示，兩個基因的擴增曲線均呈典型的S型，基線平整，指數(shù)區(qū)斜率較大且比較平滑，空白對照一直保持水平，擴增曲線比較理想；熔解曲線只有單一峰，說明沒有引物二聚體和非特異性擴增的產(chǎn)生。

圖1 PVY基因和actin基因的標準曲線Fig 1.Standard curve of PVY and actin gene

圖2 PVY基因和actin基因標準系列擴增曲線Fig.2 Amplification plots of PVY gene and actin gene at different template amounts

圖3 PVY基因和actin基因熔解曲線Fig.3 Melting curve of PVY gene and actin gene

1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PVY基因和actin基因的Real-time PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)(Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS)采集圖像，結(jié)果如圖4所示。目的條帶單一，條帶大小與預期設(shè)計相符，進一步說明無引物二聚體和非特異性擴增的產(chǎn)生。

圖4 1.5%瓊脂糖電泳檢測PVY基因和 actin基因 Real-time PCR產(chǎn)物Fig.4 PVY gene and actin gene Real-time PCR products detected by 1.5% agarose gel

2.3 Real-time PCR定量檢測的重現(xiàn)性分析

以6個稀釋的系列cDNA為模板進行Real-time PCR，3次重復的Ct值誤差和變異系數(shù)如表1所示，均較小，說明該體系的重現(xiàn)性好。

表1 重現(xiàn)性分析(Ct值)Table 1 Repeatability test

2.4 Real-time PCR定量檢測體系的應用分析

采自廣西百色呈典型煙草病毒病的30個樣品，用ELISA試劑盒檢測出8個煙草樣品被PVY侵染；用Real-time PCR定量檢測體系檢測出被PVY侵染的樣品有12個。DAS-ELISA試劑盒的檢測稀釋極限為105；而Real-time PCR定量檢測體系的檢測稀釋極限為109。以上結(jié)果說明，PVY Real-time PCR定量檢測體系與DAS-ELISA相比，具有較高的靈敏性。并且，使用DAS-ELISA檢測耗時兩個工作日，而利用Real-time PCR檢測在1個工作日內(nèi)可以得到檢測結(jié)果，具有高效性。

3 討 論

目前，檢測 PVY的方法主要集中于生物學鑒定、光鏡和電鏡觀察、免疫學方法、RT-PCR檢測技術(shù)、核酸雜交檢測技術(shù)等。對 PVY的生物學鑒定主要依據(jù)寄主植物和傳播方式，耗時長，受環(huán)境影響較大，檢測結(jié)果不可靠。光學顯微鏡觀察主要是基于 PVY在寄主細胞內(nèi)形成風輪狀、柱狀、片層狀的內(nèi)涵體[1]。電鏡負染技術(shù)鑒定病毒優(yōu)點是直接、快速，尤其是免疫吸附電鏡，具有較高的靈敏性和特異性，但是不適合于樣品過多時使用。并且電鏡昂貴，操作電鏡需要一定的技術(shù)水平，不能達到普遍應用的效果。RT-PCR檢測技術(shù)，耗時較短，成本低，具有較高的靈敏性和特異性，因此一直受到普遍應用。核酸斑點雜交技術(shù)(NASH)檢測病毒應用也比較廣泛，Singh等[4]利用此技術(shù)檢測了馬鈴薯休眠塊莖中的PVY病毒，發(fā)現(xiàn)NASH比ELISA法更靈敏，更可靠，但是靈敏度和特異性比 RT-PCR差，而且在檢測大量樣品時，探針分離比較困難[5]。隨著分子生物學的發(fā)展，各種新技術(shù)不斷推出，需要建立更為精確的檢測PVY的技術(shù)體系。

本研究通過與DAS-ELISA檢測技術(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)Real-time PCR定量檢測技術(shù)具有更高的靈敏性，且檢測耗時短，效率高。但是real-time PCR定量檢測技術(shù)需要較昂貴的儀器設(shè)備，不適合于規(guī)模較小的實驗室，這是該技術(shù)體系在應用過程中的一個弊端。

孫淑斌等[6]研究指出，real-time PCR可以通過3種主要方法，達到理想的擴增效果：縮短操作時間，盡量在冰上操作；專業(yè)設(shè)計軟件設(shè)計適合的實時PCR引物；優(yōu)化反應條件，改變退火、延伸溫度，反應物濃度等。本研究設(shè)計按照標準熒光定量PCR引物設(shè)計原則，用Primer 5.0進行設(shè)計，然后通過Oligo 6.0軟件對所設(shè)計的引物進行評價，并通過在線BLSAT程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進行驗證，設(shè)計的引物具有較高的特異性和最小的二級結(jié)構(gòu)。并且通過優(yōu)化反應條件,最終確立了PVY real-time PCR定量檢測體系，為快速、靈敏、高效地定量檢測馬鈴薯Y病毒提供了有力的技術(shù)支持。

[1]朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國煙草病害[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：209-216.

[2]路平.馬鈴薯三種主要病毒的ELISA和RT-PCR檢測技術(shù)的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2005.

[3]杜志游.馬鈴薯病毒和類病毒的分子診斷方法研究[D].杭州：浙江大學，2006.

[4]Singh M,Singh P R,Moore L.Evaluation of NASH and RT-PCR for the detection of PVY in the Dormant Tubers and its comparison with visual symptoms and ELISA in plants[J].Amer J of Potato Res,1998,76(2):61-66.

[5]Rudra P Singh.Development of the molecular methods for potato virus and viroid detection and prevention[J].Genome,1999,42:592-604.

[6]孫淑斌，李寶珍，胡江，等.水稻低豐度表達基因OsAMT1;3熒光定量PCR方法的建立及其應用[J].中國水稻科學，2006，20(1)：8-12.