香料煙青枯病抗性基因的遺傳分析

高加明，王志德，張興偉，劉艷華，牟建民，任 民，徐 軍

（1.農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081）

青枯病是一種由假單胞桿菌屬細菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種破壞性極強的土傳病害，是典型的維管束病害，最顯著的癥狀是枯萎。煙草青枯病是煙草的重要病害，一旦發(fā)病即可造成全株死亡，對煙葉生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。目前，煙草生產(chǎn)上主要采取藥劑、生物以及輪作等方式防治青枯病，但各種防治措施都存在著各自的不足及局限性，因而無法從根本上進行防治。因此，明確煙草青枯病抗性的遺傳規(guī)律，以便采取正確的育種手段，培育抗病新品種是一種最有效的防治措施[1]。

近年來有關(guān)青枯病研究開展最多的是茄科植物，如番茄、茄子[2]、馬鈴薯[3]等。研究表明，青枯病的抗性遺傳規(guī)律有隱性遺傳、加性效應(yīng)為主的不完全顯性等，甚至有研究認為抗性在幼齡植株中表現(xiàn)不完全顯性，在成株期則為隱性等不同觀點。關(guān)于基因的個數(shù)也無定論，大多數(shù)認為受多基因控制，但也有不少研究者認為是受顯性單基因控制[4]。

煙草青枯病有幾種不同水平的抗源，大部分是中抗以下品種，很少有高抗青枯病的品系，在野生煙屬種中也未鑒定出抗病性[5]。所以從現(xiàn)有抗源中研究遺傳機理，準確了解煙草青枯病抗性基因的遺傳機理，為培育出高抗病性的煙草品種提供一定的理論依據(jù)。作者采用章元明[6]植物數(shù)量性狀混合遺傳模型主基因+多基因多世代聯(lián)合分析方法，研究了香料煙Xanthi×Samsun組合的F2分離群體的病情指數(shù)的遺傳規(guī)律，為優(yōu)質(zhì)抗病香料煙新品種的選育提供依據(jù)[7]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選用青枯病抗病品種 Xanthi和感病品種Samsun配置雜交組合。2008年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨基地種植親本，進行雜交，收獲F1種子。并于當年9月份在溫室加代，套袋自交，翌年2月收獲F2種子。

1.2 試驗設(shè)計

將親本、F1和 F2種于福建省三明市青枯病病圃，此病圃是國家定點青枯病抗性鑒定病圃，調(diào)查煙草青枯病病情。試驗設(shè)3個重復(fù)，完全隨機區(qū)組設(shè)計，3個小區(qū)，每個小區(qū)40株。對照品系栽在中間，設(shè)抗病品種 D101，感病品種長脖黃為對照。按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行田間管理。

1.3 青枯病病情調(diào)查

由當?shù)卦囼灱夹g(shù)人員按YC/T39-1996行業(yè)標準進行調(diào)查[8]，分別調(diào)查3次，以發(fā)病高峰期的調(diào)查數(shù)據(jù)作為分析數(shù)據(jù)，并計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用章元明[6]植物數(shù)量性狀混合遺傳模型主基因+多基因多世代聯(lián)合分析方法對 Xanthi×Samsun組合P1、P2、F1和F2等4個世代單株的病情指數(shù)進行分析，通過比較1對主基因(A)，2對主基因(B)，多基因(C)，1對主基因+多基因(D)和 2對主基因+多基因(E)等5類24種遺傳模型的AIC值，并進行遺傳模型的適合性測驗，包括均勻性檢驗(U12，U22和U32)，Smirnov檢驗(nW2)和Kolmogorov 檢驗(Dn)，綜合考慮極大似然函數(shù)、AIC值和適合性檢驗的結(jié)果確定最優(yōu)模型。最后估算最適合模型的主基因和多基因效應(yīng)值、遺傳率等一階遺傳參數(shù)和二階遺傳參數(shù)等[9]。

在主基因+多基因的混合遺傳模型中，表現(xiàn)型值(p)表示為群體平均數(shù)(m)、主基因效應(yīng)(g)、多基因效應(yīng)(c)和環(huán)境效應(yīng)(e)之和，即p=m+g+c+e，因此，表現(xiàn)型方差(σp2)可表示為主基因方差(σmg2)、環(huán)境方差(σe2)和多基因方差(σpg2)之和，即σp2=σ e2+σmg2+σpg2。分離群體的主基因方差(σmg2)等于表現(xiàn)型方差(σp2)減去純合主基因型成分分布方差。多基因方差(σpg2)為純合主基因型成分分布方差減去環(huán)境方差(σe2)。主基因遺傳率 hmg2(%)=σmg2/σp2×100%；多基因遺傳率 hpg2(%)=σpg2/σp2×100%。

2 結(jié) 果

2.1 4世代田間病情調(diào)查結(jié)果

對親本、F1和F2的調(diào)查結(jié)果見表1。結(jié)果表明，3個重復(fù)之間的病情差異不顯著。P1是感病品種，病情指數(shù)為 77.50；P2是抗病品種，病情指數(shù)為13.75。雜交獲得的 F1代為中抗型，其病情指數(shù)略高于親本的平均值。后代F2的表型分布呈現(xiàn)雙峰偏態(tài)分布，作者認為它有可能既有主效基因的作用，又有微效基因的作用。

表1 4世代煙草青枯病的病情分布Table 1 Disease distribution for four generations of tobacco bacterial wilt

2.2 田間抗性的統(tǒng)計遺傳分析

用4世代聯(lián)合分離分析方法，通過IECM算法獲得1對主基因(A)，2對主基因(B)，多基因(C)，1對主基因+多基因(D)和 2對主基因+多基因(E)等 5類24種遺傳模型的極大似然函數(shù)值和AIC值，見表2。根據(jù)AIC值準則，AIC值小的遺傳模型為可能最佳模型。從而選出AIC值小的E-1、E-3、E-4、E-5和E-6作為備選模型。然后對其5個備選模型進行適合性(U12、U22、U32、nW2和Dn)檢驗，結(jié)果見表3。選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)較少的模型作為最優(yōu)模型。由表3可知，20個適合性檢驗統(tǒng)計量中，E-1模型中只有2個達到顯著水平(α=0.05)，即有2個適合性檢驗統(tǒng)計量表明E-1模型與群體的分布是不一致的[10]；其它4個模型中均有11個達到顯著水平(α=0.05)。因此選擇 E-1模型，即 2對加性-顯性-上位主基因+加性-顯性多基因混合模型為煙草青枯病抗性遺傳的最優(yōu)模型。

表2 Xanthi×Samsun組合青枯病抗性在不同遺傳模型下的MLV和AIC值Table 2 Maxinum likelihood value(MLV) and Akaike’s information criterion(AIC) for resistance to bacterial wilt in the cross of Xanthi×Samsun under different genetic models

表3 Xanthi×Samsun組合青枯病抗性遺傳模型的適合性檢驗Table 3 Tests on goodness-of-fit of genetic models for resistance to bacterial wilt in the cross of Xanthi×Samsun

2.3 遺傳參數(shù)的估計

此模型遺傳參數(shù)的估計見表4。從一階遺傳參數(shù)可以看出煙草青枯病抗性基因2對主基因的加性效應(yīng)∣da∣≈∣db∣，說明 2對主基因的加性效應(yīng)幾乎相等，但是符號相反，幾乎可以抵消；2對主基因的顯性效應(yīng)∣ha∣=∣hb∣，即顯性效應(yīng)相等；2對主基因顯性度的絕對值∣ha/da∣、∣hb/db∣都小于1，說明2對主基因的加性效應(yīng)大于顯性效應(yīng)，2對主基因都以加性效應(yīng)為主；2對主基因間的加性互作為負值，說明兩基因同時存在時植株容易感?。坏?對主基因的顯性效應(yīng)×第2對主基因的加性效應(yīng)大于第1對主基因的加性效應(yīng)×第2對主基因的顯性效應(yīng)，并且同為正值，說明育種中更應(yīng)該注重第1對主基因的顯性效應(yīng)×第2對主基因的加性效應(yīng)之間的互作，更利于提高后代的抗病能力；2對主基因的顯性互作為0.2076；多基因的加性效應(yīng)大于主基因的加性效應(yīng)，說明多基因的影響還是比較大的。

表4 最適遺傳模型E-1下抗性基因的遺傳參數(shù)估計Table4 The estimates of genetic parameters for resistant gene under the E-1 model

二階遺傳參數(shù)，主基因的遺傳率為49.63%；由于環(huán)境誤差影響很大，導(dǎo)致多基因方差為負值，說明煙草青枯病的發(fā)生受環(huán)境因素影響比較大，今后應(yīng)該從試驗設(shè)計、田間種植等方面減小環(huán)境因素的影響，估計出準確的多基因遺傳率。

3 討 論

前人研究表明，對于煙草青枯病抗性的遺傳機理還沒有統(tǒng)一的定論。Matsuda和Ohashi (1973)報道Awa、Hatano、Kokubu 與Odaruma 等中抗品種的抗性受部分顯性基因Rps控制，高抗品種Enshu、Hatanodaruma的抗性不僅受Rps基因控制，還受多基因影響[11]。在國內(nèi)，楊友才等[4]通過使用強致病力的單一菌株，對煙草抗性資源 Ti448A的抗性遺傳機理進行了研究，結(jié)果表明煙草青枯病抗性是受顯性單基因控制，并從分子水平上進行了進一步的驗證，結(jié)果抗病與感病的分離比為3:1，符合 1對顯性基因控制的遺傳規(guī)律。出現(xiàn)不同結(jié)果可能是由于以下原因：一是試驗所選的材料不同，不同抗源的遺傳機理不同；二是病原菌的不同，青枯菌菌系分化比較復(fù)雜，當在田間自然發(fā)病時，只有這些位點上的抗性基因均為顯性時，才表現(xiàn)為抗病，若一處為隱性，則有可能表現(xiàn)為感病，這樣就會導(dǎo)致病情的差異；三是環(huán)境的不同，從分析結(jié)果也可以看出環(huán)境對煙草青枯病有很大的影響，不同環(huán)境導(dǎo)致病情的分化很大。

本研究通過對香料煙品種 Xanthi×Samsun組合P1、P2、F1和F2等4個世代采用主基因+多基因混合遺傳模型進行了聯(lián)合分析，結(jié)果表明煙草青枯病抗性是受 2對加性-顯性-上位主基因+加性-顯性多基因（E-1模型）控制遺傳，與前人研究比較一致。Matsuda[11]認為Xanthi的抗性不僅由部分顯性基因控制，還包括多基因的影響。但無論是主基因、多基因的加性、顯性效應(yīng)，還是主基因間的互作效應(yīng)都非常?。粡闹骰虻倪z傳率來看，煙草青枯病的發(fā)生受環(huán)境因素的影響比較大。

本研究對表型數(shù)據(jù)進行了分析，其結(jié)果是初步的。Nishi 等[1]利用來自白肋煙品種間雜交(W6×Michinoku)所產(chǎn)生的125 個株系的DH 群體，構(gòu)建了第一張白肋煙 AFLP分子遺傳連鎖圖。將W6中抗青枯病的一個QTL定位到一個長32cM含有 15個標記的連鎖圖譜上。此位點可解釋的表型變異高于30%。隨著SSR引物的不斷開發(fā)，目前正在利用SSR、SRAP等分子標記來構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，從而對青枯病抗性進行基因定位，進而獲得與目標基因緊密連鎖的分子標記，為進行分子標記輔助選擇（Marker-Assisted Selection,MAS）培育新品種提供了可能[12]。

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