CCD無損測量生物組織光學(xué)參數(shù)的實驗研究

楊 麗，孫建華，張連順

（中國民航大學(xué)理學(xué)院，天津 300300）

激光與生物組織間的相互作用規(guī)律是激光生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)和前提，激光在生物組織中的衰減主要包括光子的被吸收和被散射，通常以吸收系數(shù)和有效散射系數(shù)來表示。確定組織體尤其是人體組織的光學(xué)特性參數(shù)，即吸收系數(shù)μa、有效散射系數(shù)μs′和散射相位函數(shù)或散射各項因子g以及折射率n等是生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)中的關(guān)鍵性工作[1]。漫反射光在組織表面的分布是由組織的光學(xué)特性確定的，可以通過測量生物組織表面漫反射光的分布來研究生物組織本身的光學(xué)特性[2]。測量組織表面的漫反射光分布的方法主要有：光纖逐點掃描法和CCD視頻攝像測量法。傳統(tǒng)的光纖逐點掃描存在如下問題：測量時間較長，測量過程中光纖與組織表面的距離可能發(fā)生變化；近光源區(qū)的光分布無法測量；集成光纖陣列接觸組織表面測量，組織表面會因受壓而對組織的實際生理狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響。用CCD測量生物組織表面的漫反射光、透射光分布是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的新技術(shù)[3]。從原理上，CCD視頻攝像技術(shù)具有易于控制、效率較高的優(yōu)點，并且可以測量近光源區(qū)的光強(qiáng)空間分布。R.A.Bolt[4]運(yùn)用CCD測定了一些生物組織模型的反射率隨位置的分布，Alwin Kienle[5]測定了牛肌肉、牛肝、牛脂肪和雞胸肉的反射率，在處理方法上，R.A.Bolt和Alwin Kienle按照漫射理論和隨機(jī)游走理論推算出了樣本的光學(xué)特性參數(shù)[4－5]，但所采用的光路和處理方法比較復(fù)雜。

在本研究中，簡化了上述兩人的測量光路，用二維CCD測量裝置以及配套的圖像處理軟件測量了生物組織模擬液（Intralipid－20%稀釋液）表面的漫射光分布，實驗所得的結(jié)果與Monte Carlo模擬所得的結(jié)果做了比較，對比的結(jié)果顯示兩者在10mm范圍內(nèi)的符合程度較高，證明了所設(shè)計裝置的合理性。通過漫射近似理論所獲得的表面漫射光分布的解析表達(dá)式對實驗結(jié)果進(jìn)行了Matlab非線性擬合，反演獲得了生物組織模擬液的光學(xué)參數(shù)，實現(xiàn)了光學(xué)參數(shù)的無損測量。

1 CCD實驗裝置及測量方法

用CCD測量生物組織空間分辨的漫射光分布的裝置如圖1所示。He－Ne激光器發(fā)出的激光光束（波長632.8 nm，功率為11.13 mW）經(jīng)衰減器、光欄（φ=1.0 mm）、反光鏡和聚焦透鏡以較小的入射角（5°～10°）入射到組織樣品的表面上，小的入射角可避免垂直入射時樣品表面的鏡面反射對CCD成像的影響。由于CCD攝像所需的入射光功率較小，一般在1～100 μW范圍內(nèi)，因此用光衰減器對入射光束功率進(jìn)行衰減以防止CCD飽和；凸透鏡用于改變?nèi)肷涔獾墓馐睆?，實驗選用的光束直徑φ=1 mm。測量所用CCD為150CLM型數(shù)碼顯微鏡用冷卻型，分辨率為1 392×1 040像素，靈敏度設(shè)置為200，曝光時間設(shè)置為1/10s。光束入射到組織樣品表面其漫反射光形成以入射光束入射點為中心光強(qiáng)逐漸向外衰減的圓形分布，由二維CCD探測器對其成像，CCD輸出圖像數(shù)據(jù)饋送到CCD控制器進(jìn)行存儲和簡單計算，再送計算機(jī)作進(jìn)一步的圖像分析和處理。

實驗采用了與CCD配套的圖像分析系統(tǒng)Simple－PCI（Hamamatsu公司開發(fā)）對CCD攝取的漫反射光圖像進(jìn)行處理和分析，以更簡便、更迅速及更準(zhǔn)確的方法再現(xiàn)、收集、分析圖像的細(xì)節(jié)。

標(biāo)定的方法是在被拍攝的組織樣品表面的位置安裝毫米刻度的標(biāo)尺，用拍攝組織樣品的方法拍攝標(biāo)尺的圖像，由圖像可以確定標(biāo)尺的某一長度與像素的比例關(guān)系。

實驗所用樣品為生物組織模擬液（Intralipid－20%稀釋液）。實驗樣品的制備方法是：取10 mL脂肪乳母液，加入蒸餾水稀釋成100 mL。樣品標(biāo)記為I10。實驗中樣品的厚度保持30 mm。

2 測量結(jié)果與分析

2.1 樣品表面漫射光分布的測量結(jié)果與分析

用CCD拍攝的樣品I10表面的漫反射光分布如圖2所示。圖3是樣品I10表面漫反射相對光強(qiáng)隨像素點位置變化的分布圖像。

在保持樣品測量條件不變的情況下用CCD拍攝了刻度尺的圖像，如圖4所示，由圖4可以確定1 mm距離對應(yīng)31個像素點，按此比例常數(shù)可以將相對光強(qiáng)與像素的關(guān)系換成相對光強(qiáng)與空間坐標(biāo)的關(guān)系。

Monte Carlo模擬法首次被使用是在1983年，Wilson[6]通過該方法分析了光在生物組織中的傳播。Monte Carlo方法是在假定生物組織光學(xué)特性參數(shù)的前提下，用計算機(jī)跟蹤每一個入射光子的散射、吸收、以及傳輸過程。對大量光子進(jìn)行統(tǒng)計、平均，最終給出光在組織內(nèi)部以及表面的分布規(guī)律[7-8]。實踐證明，Monte Carlo方法精度高，且其結(jié)果與生物組織的離體切片實驗結(jié)果相一致[9]。Monte Carlo模擬法已成為研究光與強(qiáng)散射介質(zhì)相互作用的非實驗性標(biāo)準(zhǔn)。在本文的實驗中，樣品的厚度為30 mm，遠(yuǎn)大于光子在樣品中散射的平均自由程，可以近似地作為半無限大介質(zhì)處理，滿足Monte Carlo模擬所要求的條件。

本文亦將Monte Carlo模擬結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，來檢驗漫反射光圖像測量結(jié)果的精度。采用文獻(xiàn)[8]中的模擬程序?qū)Ω咚构馐肷涞綐悠稩10的表面漫射光分布情況進(jìn)行模擬，樣品的光學(xué)參數(shù)選擇如下[4]：μa=0.049 mm-1，μs=11.3 mm-1，g=0.75，n=1.40，光束直徑 φ =1 mm。

Monte Carlo模擬結(jié)果與經(jīng)過軟件分析，做歸一化及取對數(shù)處理后的樣品I10實驗測量結(jié)果的對比如圖5所示。

從圖5的對比可以看出：在距離光束中心10 mm的范圍內(nèi)兩者具有較高的一致性，但在距離光束中心10 mm以外兩者出現(xiàn)偏差，實驗測量值趨于不變，而Monte Carlo模擬值仍在繼續(xù)減小。這是由于理論計算是以半無限大介質(zhì)模型為基礎(chǔ)，在無限遠(yuǎn)處漫反射光強(qiáng)必然為0；而CCD設(shè)備無可避免地存在細(xì)微的暗電流，使圖像暗區(qū)的測量有一定誤差，因此當(dāng)測量距離光束中心超過10 mm時實驗與理論偏差逐漸增大，在遠(yuǎn)離反射光強(qiáng)光斑中心的區(qū)域，漫射光強(qiáng)極其微弱，暗電流的影響也趨于明顯，導(dǎo)致測量光強(qiáng)減少緩慢。

2.2 吸收系數(shù)μa和有效散射系數(shù)μs′的確定與分析

由于實驗樣品的尺寸遠(yuǎn)大于光子的實際傳輸路程，可以看作半無限大介質(zhì)。根據(jù)漫射近似理論，當(dāng)無限細(xì)光束垂直入射到組織表面時，在外延邊界條件下，且漫射系數(shù)D取為

對于樣品I10測量結(jié)果，分別利用Matlab程序做基于方程（2）的R（ρ）與ρ的非線性擬合，如圖6所示，同時可以得到所測樣品I10的吸收系數(shù)μa和有效散射系數(shù) μs′。

表1是本文實驗獲得的吸收系數(shù)μa和有效散射系數(shù)μs′與文獻(xiàn)[4]的比較?？梢姳疚墨@得的光學(xué)參數(shù)與R.A.Bolt等報道的數(shù)據(jù)非常接近，有效散射系數(shù)μs′的誤差為4.73%，吸收系數(shù)μa的誤差為9.79%，顯然都是在允許的系統(tǒng)誤差范圍內(nèi)[13]。分析造成上述差別的原因可能有以下幾方面的因素：所選用Intralipid-20%原液的生產(chǎn)廠商不同，液體內(nèi)部顆粒的大小及均勻性會存在差異；CCD自身的暗電流以及環(huán)境中存在微小的噪聲光源；由測量數(shù)據(jù)擬合反演光學(xué)特性參數(shù)所用算法帶來的誤差等因素的影響。

表1 測量結(jié)果與R.A.Bolt等報道的數(shù)據(jù)比較Tab.1 Comparison of experimental measurement results with that reported by R.A.Bolt，et al.

3 結(jié)語

采用CCD無損測量技術(shù)，獲得了生物組織模擬液（Intralipid-20%稀釋液）在連續(xù)的He-Ne激光光束照射下的表面漫射光分布圖像；并以Monte Carlo模擬結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，檢驗漫反射光圖像測量結(jié)果的精度。結(jié)果顯示理論計算與實驗測量結(jié)果在10 mm范圍內(nèi)相吻合。根據(jù)漫射近似理論對實驗測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，獲得了生物組織模擬液的光學(xué)參數(shù)，與報道的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明設(shè)計的實驗裝置可用于生物組織光學(xué)特性參數(shù)的無損測量。CCD無損和快速取像的特點與圖像分析系統(tǒng)Simple-PCI的配合更好地發(fā)揮了CCD在生物組織無損測量中的優(yōu)勢。通過實驗系統(tǒng)和實驗技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)與完善，有望實現(xiàn)活體生物組織的光學(xué)特性參數(shù)的測量。

[1]KASHIMA SUSUMU.Spectroscopic measurement of blood volume and its oxygenation in a small volume of tissue using red laser lights and differential calculation between two point detections[J].Optics and Laser Technology，2003，35（6）：485-489.

[2]LI ZHONG-MING，LIU XIAO-HUA.The theoretical analysis of thermal interaction between laser and bio-tissue[J].Journal of Optoelectronics·Laser，2002，13（8）：860-863.

[3]SPLINTER R，NANNY G A，LITTMAN L.Monitoring tissue optical characteristics in situ using a CCD camera[J].Laser Life Sci，1994，6：15-25.

[4]BOLT R A，BOSCH J T.Method for measuring position-dependent volume reflection[J].Applied Optics，1993，32（24）：4641-4645.

[5]ALWIN KIENLE，LOTHAR LILGE，PATTERSON M S.Spatially resolved absolute diffuse reflectance measurements for non-invasive determination of scattering and absorption coefficients of biological tissues[J].Appl Opt，1996，35（13）：2304-2314.

[6]WILSON B C，PARK Y D，HEFETZ Y，et al.Potential of Time-Resolved Reflectance Measurements for Noninvasive Determination of Tissue Optical Properties[C]//SPIE Proceedings of Thermal and Optical Interactions with Biological and Related Composite Materials.Harpole，1989：97.

[7]WANG L H，JACQUES S L，ZHENG L Q.MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues[J].Computer Methods and Programs in Biomedicine，1995，47（2）：131-146.

[8]FLOCK S T，WILSON B C，PATTERSON M S.Monte Carlo modeling of light propagation in highly scattering tissues-Ⅱ：Comparison with measurements in phantoms[J].IEEE Transaction of Biomedicine Engineering，1989，36（12）：1169-1173.

[9]REBECCA SIMPSON C，MATTHIAS KOHL.Near-infrared optical properties of ex vivo human skin and subcutaneous tissues measured using the Monte Carlo inversion technique[J].Phys Med Biol，1998，43：2465-2478.

[10]ALWIN KIENLE，PATTERSON M S.Improved solutions of the steady-state and the time-resolved diffusion equations for reflectance from a semi-infinite turbid media[J].Journal of the Optical Society of America A，1997，14（1）：246-254.

[11]AKIRA ISHIMARU.Wave Propagation and Scattering in Random Media[M].New York：Academic Press，1978：147-167.

[12]HASKELL R C，SVAASAND L O，TSAY T T.Boundary conditions for the diffusion equation in radioactive transfer[J].Opt Soc Am，1994，AⅡ（10）：2727-2741.

[13]XU HE-PING，MICHAEL S PATTERSON.Determination of the optical properties of tissue-simulating phantoms from interstitial frequency domain measurements of relative fluence and phase difference[J].Optics Express，2006，14（14）：6485-6501.