依達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬Chat、NR2B表達(dá)的影響

李妍博，張生林

（山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院老年病科，山西太原 030001）

依達(dá)拉奉是一種新型的腦保護藥，具有清除自由基、抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護作用[1]。臨床研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉在腦梗死中有顯著的神經(jīng)保護作用[2-3]。血管性疾呆（VD）是一組由于缺血或出血性的腦血管病及全腦缺血低氧引起的認(rèn)知功能障礙綜合征。本文通過觀察依達(dá)拉奉對VD大鼠海馬Chat、NR2B表達(dá)的影響，研究依達(dá)拉奉的預(yù)防及治療作用，為VD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備

實驗動物由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，選用雄性Wistar大鼠 36只，體重 200～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 2周，采用“兩血管阻斷+硝普鈉降壓法”[4]制備VD大鼠模型，B組（VD組）、C組（依達(dá)拉奉治療組）、D組（預(yù)防治療組）行雙側(cè)頸總動脈反復(fù)缺血-再灌注2次，每次10 min，同時在缺血-再灌注前給予硝普鈉2.5 mg/kg腹腔注射，A組僅暴露雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎，且不注射硝普鈉。

1.2 給藥方法

C組大鼠于術(shù)后第7天給予依達(dá)拉奉皮下注射3mg/kg，D組于造模麻醉前給予同等劑量的依達(dá)拉奉，每天1次給藥，共20 d；A組與B組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力的測定

根據(jù)Morris水迷宮實驗進行大鼠學(xué)習(xí)記憶功能測定，歷時5 d，前4 d記錄在2 min內(nèi)找到并爬上平臺的時間為大鼠的逃避潛伏期，即學(xué)習(xí)成績；第5天撤掉平臺后，記錄大鼠穿越平臺的次數(shù)以測試其記憶能力。

1.4 制備組織切片

各組動物分別于造模后第30天處死，灌洗固定后剝?nèi)『ｑR組織，石蠟包埋，脫蠟，應(yīng)用免疫組化方法制片。

1.5 灰度值分析

各組取海馬CA1、CA3區(qū)各10個測試點，求平均值進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果 見表 1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果（）

表1 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果（）

與 A 組比較，▲P＜0.05；與 B 組比較，●P＜0.05；與 C 組比較，■P＜0.05

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2.1.1 定位航行實驗結(jié)果 B組逃避潛伏期均較A、C、D組延長（P＜0.05），D 組較 C 組逃避潛伏期縮短（P＜0.05）。

2.1.2 空間搜索實驗結(jié)果 B組穿越平臺次數(shù)較A、C、D組減少（P＜0.05），D 組較 C 組次數(shù)增加（P＜0.05），說明 B 組記憶能力較其他三組均降低，D組較C組記憶能力提高。

2.2 圖像灰度值分析

與A組比較，B組海馬CA1、CA3區(qū)的Chat及NR2B表達(dá)明顯，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），C組、D組與B組比較，海馬 CA1、CA3 區(qū)的 Chat及 NR2B 表達(dá)增加（P＜0.05），但較 A 組減少（P＜0.05）。 見表 2。

表2 各組大鼠海馬 CA1、CA3區(qū)Chat、NR2B表達(dá)（）

表2 各組大鼠海馬 CA1、CA3區(qū)Chat、NR2B表達(dá)（）

與 A 組比較，■P＜0.05，▲P＜0.01；與 B 組比較，●P＜0.05

3 討論

本實驗結(jié)果表明，B組大鼠逃避潛伏期明顯延長，而C組與D組較B組均縮短，且D組與A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明依達(dá)拉奉能夠改善VD大鼠的認(rèn)知，同時說明依達(dá)拉奉有預(yù)防VD發(fā)生的作用。其機制可能與依達(dá)拉奉能夠抑制脂質(zhì)過氧化、清除過量自由基、保護細(xì)胞線粒體、阻止自由基釋放而引起的遲發(fā)型的組織損害有關(guān)[5]。

Chat是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志，Chat免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元減少與大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙程度呈正相關(guān)[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Chat蛋白在B組海馬區(qū)表達(dá)極少，可能是因為腦組織遭受自由基的氧化損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在C組與D組中其表達(dá)增加可能是因為依達(dá)拉奉清除過量生成的自由基保護細(xì)胞線粒體，抑制脂質(zhì)過氧化作用和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[2]，阻止了caspase-3的活化[7]，提高了Bcl-2的表達(dá)[8]，減少了缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

NR2B是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，在學(xué)習(xí)和記憶中起關(guān)鍵作用[9]。腦缺血引起神經(jīng)元去極化，導(dǎo)致谷氨酸（Glu）的大量釋放，Ca2+內(nèi)流主要由谷氨酸受體的一種亞型NMDA受體通道介導(dǎo)，Ca2+超載造成神經(jīng)元損傷，這就是Glu對神經(jīng)元的興奮毒性損傷[10]。本研究中，VD大鼠海馬NR2B表達(dá)減少的機制可能與海馬缺血、低氧致神經(jīng)元死亡或結(jié)構(gòu)受損有關(guān)，也可能與神經(jīng)元低代謝影響神經(jīng)傳遞有關(guān)，而經(jīng)依達(dá)拉奉干預(yù)后NR2B表達(dá)增加可能與依達(dá)拉奉能夠抑制谷氨酸釋放[11]，進而改善局部腦血流量和腦微循環(huán)及腦能量代謝有關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，C組Chat及NR2B表達(dá)與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但水迷宮實驗中D組較C組學(xué)習(xí)記憶能力提高，可能仍有其他機制的影響，有待于進一步研究。

[1]Shimon A,Tatsushi K,Chika KON,et al.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of edaravone following transient focal ischemia in rats[J].Eur J Pharmacol,2005,516(2):125-130.

[2]Edaravone Acute Infarction Study Group.Effect of a novel free radical scavenger,edaravone(MCI2186),on acute brain infarction.Randomized,placebo-controlled,double-blind study at multicenters[J].Cerebrovas Dis,2003,15(3):222-229.

[3]Watanabe T,Tanaka M,Watanabe K,et al.Research and development of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotectant[J].Yakugaku Zasshi,2004,124(3):99.

[4]王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進[J].中國病理生理雜志,2000,16(10):914.

[5]Ikeda T,Xia YX.Effect of the free radical scanvenger,3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolirr-5-one(MCI-186),on hypoxia-ischemia-induced brain injury in neonatal rats[J].Nero Lett,2002,329(1):33-36.

[6]范文輝,李露斯,劉之榮,等.血管性癡呆的動物模型、神經(jīng)病理及其膽堿能機制[J].中國臨床康復(fù),2002,6(21):3172-3173.

[7]Xiao B,Bi FF,Hu YQ,et al.Edaravone neuroprotection effected by suppressing the gene expression of the Fas signal pathway following transient focal ischemia in rats[J].Neurotox Res,2007,12(3):155-162.

[8]Miyasou T,Kwon AH,Tsuji K,et al.Edaravone prevents Fas-induced culminant hepatic failure in mice by regulating mitochondrial Bcl-xl and Bax[J].Shock,2008,30(2):212-216.

[9]Loftis JM.The N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2B:localization,functional properties,regulation,and clinical implications[J].Pharmacol Ther,2003,97(1):55-85.

[10]Choi DW.Calcium:still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death[J].J Trend Neuro,1995,18(2):58-60.

[11]李高義,陳勁草,孟肖麗,等.依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護作用的研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報,2008,37(1):114-116.