火絨草抗急性炎癥藥效物質基礎初步研究

姜 鴻， 侯 政， 邸子真， 王光函， 尤獻民

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽110034)

火絨草Leontopodium leontopodioides(Willd.)Beauv為菊科火絨草屬植物的干燥全草。我國主要分布于東北、西北、華北及西南地區(qū)，青藏高原，在遼寧范 圍內多生長于針葉、闊葉林交界處的低矮草叢中?；鸾q草味微苦，性寒;入腎、膀胱二經(jīng);具有清熱涼血、消炎利腎的功效。其對流行性感冒，急、慢性腎炎，尿路感染，尿血，創(chuàng)傷出血等癥狀有一定的治療作用。

本研究利用極性萃取法將火絨草提取液分離成不同極性化學成分群，對不同化學成分群進行抗急性炎癥試驗，將藥效學實驗結果與各提取物指紋圖譜峰相對峰面積相關聯(lián)，通過SPSS統(tǒng)計軟件的相關分析初步確定火絨草藥材與抗急性炎癥作用相關的色譜峰，為火絨草藥效物質基礎的進一步深入研究奠定理論基礎。

1 提取物制備

取火絨草藥材，加水10倍量和8倍量分別提取2次，每次提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至體積與藥材投料比約為1∶2時，放涼，量取1/2溶液，濃縮并減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，加糊精稀釋成1 g樣品含10 g藥材的粉末，作為1號提取物;剩余1/2溶液置分液漏斗中，分別用等倍量石油醚(30～60℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取5次，分別合并各自萃取溶液，回收溶劑，減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，分別加入糊精適量，配制成1 g樣品含10 g藥材的粉末:2號提取物(石油醚層)、3號提取物(乙酸乙酯層)、4號提取物(正丁醇層);取經(jīng)過上述溶劑萃取后的水溶液，濃縮并減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細粉，加糊精適量，配制成1 g樣品含10 g藥材的粉末，作為5號提取物。

2 提取物指紋圖譜分析

2.1 儀器與試藥 Agilent 1100高效液相色譜分析儀:四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、DAD檢測器、全自動進樣器(美國Agilent公司)。乙腈、磷酸為色譜純;娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純;火絨草藥材采自于沈陽東陵祝家地區(qū)。

2.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C185 μ(200 mm×4.6 mm);流動相A:0.2%磷酸水溶液，B:乙腈;梯度洗脫。流速:1 mL/min;DAD檢測器，檢測波長:290 nm;柱溫:25℃;譜圖記錄60 min。

2.3 供試品溶液制備 取1項下1～5號提取物各適量，分別精密稱取2 g，加蒸餾水50 mL，稱重，回流提取1 h，靜置冷卻至室溫，稱重，用蒸餾水補足減失重，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，分別取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 HPLC指紋圖譜分析 取各供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，5個提取物以提取物1為準共得到36個色譜峰，見圖1～圖5，用X1～X36分別代表各色譜峰校正后的峰面積，見表1。

圖1 提取物1指紋圖譜

圖2 提取物2指紋圖譜

將原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸混合對照溶液進樣，記錄色譜圖，并將保留時間與樣品各指紋峰比較，確認10號峰為原兒茶酸、13號峰為原兒茶醛、14號峰為綠原酸、16號峰為咖啡酸，見圖6。

圖3 提取物3指紋圖譜

圖4 提取物4指紋圖譜

圖5 提取物5指紋圖譜

圖6 照品溶液HPLC圖

表1 火絨草提取物的峰面積

3 提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用

選取72只昆明種小白鼠，隨機分為6組，每組12只，分別為空白對照組，1、2、3、4、5號提取物組。各組動物按相應劑量灌胃給予相對應藥液，給藥容積均為20 mL/kg，空白對照組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后，在小鼠右耳正反兩面用微量加樣器各滴加20 μl二甲苯致炎。20 min后各小鼠脫臼處死，剪下左右兩耳，以9 mm打孔器打下兩個耳片，電光天平稱重，計算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率，腫脹度=右耳－左耳;腫脹抑制率=［(空白對照組腫脹度均值－用藥組腫脹度均值)/空白對照組腫脹度均值］×100%。結果見表2。

由表2試驗結果可見，與空白對照組比，3號提取物有極顯著差異，1號提取物有顯著差異，其余各提取物無顯著性差異。

4 數(shù)據(jù)處理

4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 將指紋圖譜化學數(shù)據(jù)(表1)和抗炎試驗數(shù)據(jù)(表2)組成原始數(shù)據(jù)矩陣，自變量X1～X36代表各色譜峰校正后的峰面積，因變量Y代表藥理指標-腫脹抑制率，組成矩陣，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用相關分析的方法探討火絨草藥材中可能的藥效物質基礎。

表2 火絨草提取物對小鼠耳腫脹度的影響(n=10、±s)

表2 火絨草提取物對小鼠耳腫脹度的影響(n=10、±s)

注:與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01(下同)。

/%空白對照組別 腫脹度/mg 腫脹抑制率7.74±1.36 2.647.95±1.12 -1號提取物 5.89±1.28* 25.912號提取物 7.82±1.23 1.643號提取物 5.39±1.53** 32.204號提取物 7.42±1.51 6.675號提取物

4.2 相關分析 相關分析(Correlate)是研究變量之間密切程度的一種統(tǒng)計方法。有雙變量相關分析(Bivariate)、偏相關分析(Partial)等。當分析多個變量之間的關系，而這種關系又往往是變量之間的數(shù)量關系時，通常采用雙變量相關分析方法。使用SPSS軟件(13.0版)中的雙變量相關分析可以得到變量兩兩之間的皮爾遜系數(shù)(Pearson Correlation Coefficients)及其統(tǒng)計量。表3列出的是雙變量相關分析(Bivariate)方法處理所得的Pearson相關系數(shù)。

表3 36個色譜峰的相對峰面積與抑制率相關分析結果(皮爾遜系數(shù))

與 Y 相關的變量有:X7、X13、X16、X30、X31、X35、X36;與 Y密切相關的變量有:X11、X14、X24、X28、X34。通過相關分析，這12個化學組分可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質基礎。

4.3 回歸分析 采用“有進有出”的回歸分析方法，從一個自變量開始，視各個自變量X對因變量Y作用程度的顯著，將顯著變量逐個引入回歸方程，而原引入的變量因后引入的新變量而變得不顯著時，則將其剔除，每一步都進行F檢驗，以保證方程中只包含顯著變量。這個過程反復進行直到再無新變量引入，也無變量被剔除，逐步回歸完成，建立回歸方程。共有X6、X15、X18、X36等20個變量被引入回歸方程。

X6、X18化學組分與提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制作用負相關，與藥效預期的結果相反，因此被剔除。

X15、X36化學組分與腫脹的抑制作用正相關，可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質成分。在分析過程中同時發(fā)現(xiàn)有多重共線性情況，X36與 X7、X11、X13、X14、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35等 12 個組分顯著正相關，這 12 個化學組分也應是火絨草抗急性炎癥的藥效物質成分。因此經(jīng)過回歸分析，X7、X11、X13、X14、X15、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35、X36等14個組分可能為火絨草抗急性炎癥的藥效物質基礎。

5 討論

中藥藥效物質基礎是中藥現(xiàn)代化的研究核心，以中藥的主要功效和配伍理論為指導，采用恰當?shù)乃幚砟Ｐ驮u價藥效，利用現(xiàn)代分離、分析技術篩選、提取、分離與藥效密切相關的化學成分群，進而闡明化學成分與藥理活性的關系，確定中藥藥效物質基礎，是中藥現(xiàn)代化基礎研究的主要內容。

本研究將指紋圖譜技術運用于其復雜成分的化學信息的采集，將化學信息與藥理實驗結果相關聯(lián)，對其進行降維處理，得出與藥效相關性比較大的少數(shù)組分作為藥效物質基礎，探索了中藥藥效物質基礎研究的思路。綜上所述，研究了中藥火絨草的色譜指紋圖譜和藥效物質基礎，從36個色譜峰中有效地抽提出14個變量初步確定為藥效物質基礎，對中藥藥效物質基礎研究進行了有意義的探索，對中藥復方藥效物質基礎研究也有一定的借鑒意義。

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