組織工程化骨修復(fù)下頜骨缺損(附3例報(bào)告)

周曉 曹誼林 崔磊 喻建軍 李贊 陳杰 左朝暉 劉廣鵬 莫逸 胡炳強(qiáng) 吳勝其

下頜骨位于面下中1/3，頜面部腫瘤切除手術(shù)常導(dǎo)致下頜骨缺損，傳統(tǒng)的修補(bǔ)方法主要是骨移植，但由于骨源的限制和自體供區(qū)的損傷，仍不是理想的修復(fù)方法。組織工程是利用種子細(xì)胞和與可降解支架材料復(fù)合的方法，在體內(nèi)形成具有生理功能的組織，該方法有望成為骨缺損修復(fù)的理想方法[1]。在多種大型哺乳動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)在體外能被誘導(dǎo)為具有成骨特征的細(xì)胞，利用其作為種子細(xì)胞所形成的組織工程化骨能成功地修復(fù)骨缺損[2]。上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用自體BMSCs形成的組織工程化骨成功修復(fù)了犬下頜骨缺損[3]，在此基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用患者自身的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)為種子細(xì)胞，修復(fù)了人頜面部腫瘤切除術(shù)后的下頜骨缺損，并通過(guò)PET-CT檢測(cè)了組織工程化骨在人體內(nèi)的形成過(guò)程，取得了滿意的治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組3例，均為男性，年齡25～44歲，術(shù)前三維CT檢查示下頜骨囊腫，均采用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損。

1.2 方法

1.2.1 組織工程骨的體外培養(yǎng)

1.2.1.1 自體hBMSC的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)

從患者髂前上棘經(jīng)穿刺取得骨髓5～8 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液(密度1.073 g/L)，骨髓與分離液的比例為1∶2，2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，PBS洗1次，1 550 r/min離心后棄上清，獲取有核細(xì)胞，以2×107cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增，以成骨條件培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。使用的培養(yǎng)液為DMEM，加入β-磷酸甘油鈉(10 nmol/L)、地塞米松(10-8mol/L)、L-α-磷酸抗壞血酸(50 μmol/L)、L-谷氨酰胺(300 mg/L)、1,25(OH)2VD3(10 nmol/L)和10%自體血清。原代細(xì)胞接種后48 h換液，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后，采用0.25%胰酶消化，2×103cells/cm2傳代培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第3代，血球板細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.1.2 成骨誘導(dǎo)后的hBMSC的成骨表型鑒定

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，第3代細(xì)胞行鈣結(jié)節(jié)四環(huán)素?zé)晒馊旧⒉捎妹庖邿晒夥z測(cè)骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)。

1.2.1.3 hBMSC復(fù)合人部分脫鈣骨體外培養(yǎng)

人部分脫鈣骨由國(guó)家組織工程工程中心提供，脫鈣比例為30%～40%，孔隙率為62%～70%，平均孔徑280 μm，主要成分為Ⅰ型膠原。成骨誘導(dǎo)后的hBMSCs以3.5×107cells/g的濃度接種于人部分脫鈣骨上，體外培養(yǎng)1個(gè)月，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2 手術(shù)方法

患者全麻，常規(guī)消毒術(shù)野，切除下頜骨囊腫，徹底止血，顯露骨缺損，植入細(xì)胞－材料復(fù)合物，使其邊緣和周圍正常骨密切接觸。用可吸收縫線將細(xì)胞－材料復(fù)合物與周圍骨組織固定后，嚴(yán)密縫合軟組織并關(guān)閉創(chuàng)面。術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后使用抗生素抗感染。采用的治療方法經(jīng)過(guò)湖南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)，并征得患者及家屬同意。

1.3 隨訪

所有患者分別于手術(shù)后2周、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行臨床檢查和PET-CT檢查。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞－材料復(fù)合物

第3代hBMSCs形態(tài)均勻，增殖旺盛(圖1A)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周后鈣結(jié)節(jié)四環(huán)素?zé)晒馊旧蚈CN免疫熒光檢測(cè)均為陽(yáng)性(圖1B，C)。接種部分脫鈣骨體外構(gòu)建組織工程化骨后，倒置顯微鏡下觀察，部分脫鈣骨有良好的生物相容性，細(xì)胞接種3～4 h可見(jiàn)hBMSCs在脫鈣骨表面貼附生長(zhǎng)，細(xì)胞在脫鈣骨孔隙中粘附良好；5～8 d可見(jiàn)細(xì)胞和其分泌基質(zhì)充滿脫鈣骨的孔隙(圖1D)。

2.2 組織工程化骨治療下頜骨缺損

全部患者術(shù)后PET-CT檢查示，植入的細(xì)胞材料復(fù)合物形成高密度影，提示組織工程骨形成并修復(fù)骨缺損區(qū)。表明術(shù)后外形明顯改善，且能維持長(zhǎng)期穩(wěn)定的療效。

3 典型病例

患者，男，43歲。2005年10月14日入院，CT檢查示中線部位見(jiàn)約5 cm×4 cm×3 cm單房狀膨脹性骨質(zhì)破壞，骨皮質(zhì)變薄，牙槽側(cè)骨質(zhì)稍稀疏，左右第1、2根尖骨質(zhì)吸收，左右第3牙根尖受壓移位。診斷:下頜骨囊腫。2005年11月24日，在全麻下行下頜骨頦部囊腫切除術(shù)加體外構(gòu)建的組織工程化骨修復(fù)術(shù)，術(shù)中將囊腫壁和少量骨壁完整切除，測(cè)量下頜骨實(shí)際缺損明顯小于囊腫大小，根據(jù)骨缺損范圍，將4周前在上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室就開(kāi)始準(zhǔn)備的6塊自體骨髓干細(xì)胞體外構(gòu)建的組織工程化骨(大小4.5 cm×2.0 cm×2.5cm)植于缺損處。留置負(fù)壓引流，逐層縫合傷口?；颊咝g(shù)后康復(fù)順利，傷口愈合良好，術(shù)后病檢:下頜骨符合牙源性角化囊腫。隨訪2年，下頜骨缺損已修復(fù)，形態(tài)良好(圖2)。

患者，男，24歲。2005年12月20日入院，CT檢查示下頜骨改變，右下頜骨可見(jiàn)多個(gè)囊性骨質(zhì)破壞、缺失。該患者3年前曾因右下頜骨囊腫在外院手術(shù)治療，故診斷為右下頜骨囊腫術(shù)后復(fù)發(fā)。2005年12月22日，全麻下行下頜囊腫切除加組織工程化骨植入術(shù)。術(shù)中見(jiàn)下頜骨體部有2 cm×2 cm和2 cm×1.5 cm大小囊腫兩個(gè)，囊腫與牙齦黏膜粘連，將兩個(gè)囊腫和粘連的牙齦黏膜切除，骨床用磨鉆磨除部分骨質(zhì)后下頜骨缺損3.5 cm×2 cm×1 cm。沖洗傷口，將4周前在上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室就開(kāi)始準(zhǔn)備的以自體骨髓干細(xì)胞體外構(gòu)建的組織工程化骨約3 cm×2 cm×1 cm大小植于缺損處。留置負(fù)壓引流，逐層縫合傷口。術(shù)后病檢:右下頜骨造釉細(xì)胞瘤。術(shù)后1月發(fā)現(xiàn)下頜骨黏膜缺損，組織工程化骨有0.5 cm×0.5 cm外露。術(shù)后2個(gè)月傷口發(fā)生感染，經(jīng)抗生素治療，保留脫鈣骨。組織工程骨部分成活，傷口逐漸愈合，治愈出院。隨訪2年，組織工程化骨已修復(fù)下頜缺損，形態(tài)良好(圖3)。

患者，男，17歲。2007年12月19日入院。CT檢查示左下頜骨頜角體部及升支內(nèi)見(jiàn)膨脹性骨質(zhì)密度減低區(qū)，囊腫大小為7.5 cm×5.7 cm×3.2 cm，左下第6、7牙根伸入囊內(nèi)。診斷為左下頜骨囊腫。2007年12月24日，全麻下行左下頜骨囊腫刮除術(shù)加體外構(gòu)建的組織工程化骨修復(fù)術(shù)。術(shù)中，切開(kāi)部分變薄的骨皮質(zhì)，將囊腫壁完整切除，沖洗傷口。根據(jù)骨缺損范圍，將事先準(zhǔn)備的6塊以自體骨髓干細(xì)胞體外構(gòu)建的組織工程化骨植于缺損處。留置負(fù)壓引流，逐層縫合傷口。術(shù)后13 d拔除引流管，次日發(fā)現(xiàn)左面部腫脹，行探查術(shù)，術(shù)中見(jiàn)組織工程化骨顏色紅潤(rùn)，無(wú)特殊異常發(fā)現(xiàn)，再放置引流管。12 d后再次拔除引流管。傷口愈合良好。術(shù)后病檢:左下頜骨牙源性囊腫。隨訪2年，組織工程化骨成活良好，下頜骨缺損區(qū)修復(fù)(圖4)。

3 討論

1993年，Vacanti等[4]將牛成骨細(xì)胞接種于聚羥基乙酸后，植入裸鼠皮下，形成組織工程化骨，證實(shí)了以組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織的可能性。袁捷等[3]研究證實(shí)了經(jīng)誘導(dǎo)的自體BMSC復(fù)合珊瑚、羥基磷灰石構(gòu)建組織工程化骨能修復(fù)犬下頜骨缺損。Schliephake等[7]以煅燒牛骨為支架，復(fù)合BMSCs，修復(fù)羊的下頜骨節(jié)段缺損，組織學(xué)結(jié)果顯示，新骨形成量較單純材料組有顯著增加。Krzy-manski等[8]將經(jīng)培養(yǎng)的BMSC與纖維蛋白復(fù)合修復(fù)兔下頜骨部分缺損，結(jié)果顯示經(jīng)培養(yǎng)的BMSCs移植較異體凍干骨移植時(shí)修復(fù)能力顯著增強(qiáng)，與自體骨移植無(wú)顯著性差異，表明BMSCs與成骨細(xì)胞具有同樣的成骨效率；與骨髓混合，可能骨髓不僅提供前體細(xì)胞，還提供生長(zhǎng)因子，后者的出現(xiàn)會(huì)提高BMSC在體內(nèi)的增殖。這些研究成果為開(kāi)展臨床應(yīng)用研究提供了依據(jù)。但是，以組織工程化骨修復(fù)骨缺損，在臨床應(yīng)用前必須解決兩個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題①組織工程化骨能否在人體內(nèi)形成；②形成的組織工程化骨在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸和遠(yuǎn)期效果能否達(dá)到臨床修復(fù)骨缺損的目的。

組織工程化骨體內(nèi)構(gòu)建的關(guān)鍵是種子細(xì)胞和支架材料。hBMSCs具有能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的特性及良好的體外增殖能力，能滿足體內(nèi)形成組織工程化骨對(duì)種子細(xì)胞“質(zhì)和量”的要求[5]。同時(shí)采用自體細(xì)胞可避免疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有多種生物材料可作為骨組織工程的支架材料[6]，如部分脫鈣骨、珊瑚、磷酸三鈣等。脫鈣骨單純臨床應(yīng)用存在體內(nèi)吸收過(guò)早，在降低免疫源性的同時(shí)，易保持骨誘導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn)，本組患者均采用人部分脫鈣骨作為支架材料。術(shù)后2周的PET-CT示:移植骨致密部分呈放射性缺損，與下頜骨分界清楚，邊緣銳利，移植松質(zhì)骨見(jiàn)放射性濃聚影，提示移植松質(zhì)骨血供豐富。術(shù)后3個(gè)月的PET-CT檢查提示:組織工程化骨與下頜骨分界模糊，提示組織工程化骨與下頜骨已融為一體，生長(zhǎng)良好。尤其是本組的第二位患者，在傷口感染的情況下，組織工程化骨仍能存活，并最終修復(fù)了骨缺損區(qū)。本組患者術(shù)后2年隨訪提示，組織工程化骨已完全修復(fù)缺損區(qū)，形態(tài)良好，效果穩(wěn)定。

組織工程化骨在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用具有明顯優(yōu)勢(shì):從少量骨髓中分離hBMSCs，經(jīng)體外大規(guī)模擴(kuò)增后可修復(fù)大范圍的缺損，改變目前骨缺損治療中供區(qū)骨來(lái)源不足的問(wèn)題，避免對(duì)自體骨供區(qū)的損傷。形成的組織工程化骨穩(wěn)定存在，并發(fā)揮其生理功能。和傳統(tǒng)自體骨移植相比，組織工程技術(shù)修復(fù)缺損可不受缺損面積、形狀等的限制，不造成供區(qū)的組織缺損和功能障礙，因此可達(dá)到無(wú)創(chuàng)修復(fù)大范圍骨缺損的目的，易于被患者接受。德國(guó)Warnke等[9]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用組織工程化骨修復(fù)人下頜骨缺損取得了滿意的臨床療效。充分證明了hBMSCs在人體內(nèi)可形成組織工程化骨，并能修復(fù)骨缺損，展示了組織工程骨組織構(gòu)建在臨床具有廣闊的應(yīng)用前景。

但是，本臨床研究并未從組織學(xué)上來(lái)檢測(cè)組織工程化骨的成骨過(guò)程，而是應(yīng)用PET-CT動(dòng)態(tài)觀察下頜部組織工程骨的成骨過(guò)程。因此，對(duì)于組織工程化骨在體內(nèi)建立血液循環(huán)的原理，其在局部愈合和塑形過(guò)程中的變化等尚待進(jìn)一步的研究。

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