骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的研究進展

王珊珊 徐國興

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骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的研究進展

王珊珊1.2徐國興1

1.福建醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院 2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院

視網(wǎng)膜色素變性及老年性黃斑變性是嚴重威脅視力的疾病，目前臨床上缺乏有效的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 有跨胚層分化能力，在一定的條件下可以向神經(jīng)細胞分化。大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成為視網(wǎng)膜色素細胞的研究為此類疾病的治療帶來了希望，成為近年來該領(lǐng)域的研究熱點。本文對近年來不同培養(yǎng)條件對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導分化的影響以及視網(wǎng)膜前體細胞眼內(nèi)移植的進展綜述如下。

1 BMSCs體外誘導實驗

BMSCs向某一特定細胞的分化，必須依靠相應微環(huán)境所提供的各種營養(yǎng)因子來完成。原始視網(wǎng)膜發(fā)育的微環(huán)境是最適宜的微環(huán)境，這種微環(huán)境提供了BMSCs定向誘導分化所具備的各種生長因子以及營養(yǎng)成分。人工誘導分化干細胞的方法，就是對這種微環(huán)境的模擬。模擬的準確性越高，分化效率也就越高。

1.1 單用誘導介質(zhì)

1.1.1堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)：堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)誘導方法是誘導BMSCs向神經(jīng)元方向分化的經(jīng)典方法，其優(yōu)點是可以獲得較多的神經(jīng)元樣細胞，分化的陽性率為78%。劉東寧等[1]用bFGF誘導后結(jié)果與Woodbury一致。用bFGF誘導后細胞GFAP表達陰性，認為主要是向成熟神經(jīng)元方向分化，而不是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。誘導后從形態(tài)學上在細胞間建立了突觸聯(lián)系，但誘導后細胞難以長期存活，需聯(lián)合其他神經(jīng)營養(yǎng)因子進行維持培養(yǎng)，才利于長期存活。在培養(yǎng)中，劉東寧等用含10 ng/mL bFGF進行接觸性的誘導，有報道是用20 ng/mL bFGF進行接觸性的誘導。

1.1.2乳鼠視網(wǎng)膜細胞：采用新出生1~3天的乳鼠視網(wǎng)膜細胞作為誘導劑。有學者把將視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞培養(yǎng)換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，真空抽濾后按2∶3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后備用。用上述混合液進行BMSC細胞的誘導分化，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況。徐春玲等[2]是將新出生1~3天的乳鼠視網(wǎng)膜細胞置于Transwell雙層培養(yǎng)板的上層，這些尚未成熟的視網(wǎng)膜組織內(nèi)尚存在一些促進原始視網(wǎng)膜干細胞分化和發(fā)育的細胞因子及細胞外基質(zhì)成分，可通過上層的濾膜孔擴散至下層的BMSCs周圍，而上層的乳鼠視網(wǎng)膜細胞卻無法濾過到BMSCs周圍，從而模擬了原始視網(wǎng)膜發(fā)育的微環(huán)境。BMSCs在此微環(huán)境中，分化為具有神經(jīng)細胞形態(tài)特征的神經(jīng)樣細胞。實驗組誘導3d后，檢測到RGCs標志物Nestin陽性細胞的表達，比率為30.9%±7.7%，但7d后表達減弱(23%±4%)。

1.1.3 activin A、牛磺酸和表皮生長因子（EGF）：Anthony等[3]應用activin A、?；撬岷虴GF體外誘導分化后，發(fā)現(xiàn)有20%～32%的細胞在體外可表達感光細胞特異標志——視紫紅質(zhì)、視蛋白和recoverin。將MSC植入RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔內(nèi)，移植入視網(wǎng)膜下腔的MSC未表達細胞增殖的標志，說明MSC在移植入視網(wǎng)膜下腔后經(jīng)歷的是分化的過程而非增殖。這與Kicic A實驗的結(jié)果一致。

還有，Woodbury等利用BME、DOSO、BHA為誘導劑將BMSCs誘導成為神經(jīng)樣細胞。還有人利用中藥，如人參、丹參、當歸、黃芪等誘導BMSCs為神經(jīng)樣細胞。

2 借用支架培養(yǎng)

2.1 三維支架的選擇

三維支架培養(yǎng)是組織工程中最典型的培養(yǎng)方式，使細胞間形成適宜的空間分布和細胞連接，而且為細胞提供特異性的生長和分化信號，形成與體內(nèi)相似的細胞生長微環(huán)境，引導組織形成。近年來，BMSCs的三維培養(yǎng)已用于骨、軟骨、肌腱和脂肪等組織的工程研究，其主要的支架材料為明膠海綿、水凝膠、β-磷酸三鈣及聚己內(nèi)酯等。但應用在神經(jīng)元細胞上未見相關(guān)報道。

羊膜(human amniotic membrane，HAM)基質(zhì)：王晶等[4]采用人的HAM基質(zhì)負載BMSCs定向誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。在實驗中，觀察到BMSCs接種到HAM基質(zhì)上后能很快貼附生長，細胞活力好，折光性強，第3-10天可在HAM基質(zhì)面密集生長，這與張妍等報道相同。王晶等則認為，把HAM基質(zhì)作為細胞培養(yǎng)載體具有以下的優(yōu)點：HAM基質(zhì)主要成分為膠原纖維和網(wǎng)狀纖維，其三維支架結(jié)構(gòu)為神經(jīng)元樣細胞及其軸突的生長提供了廣闊的空間；HAM基質(zhì)免疫原性低，具有良好的生物相容性和抗炎性；HAM基質(zhì)內(nèi)的EGF、bFGF等多種生長因子為細胞的增生和分化提供了豐富的營養(yǎng)成分，HAM內(nèi)可能產(chǎn)生的某種未知的有很強神經(jīng)保護作用的因子，為神經(jīng)元樣細胞及其軸突的生長提供了更多的營養(yǎng)支持。

2.2 三維支架的誘導劑

王晶等[4]以HAM基質(zhì)作為載體，以新出生1～3 d的乳鼠視網(wǎng)膜細胞作為誘導劑進行非接觸培養(yǎng)。以HAM基質(zhì)為載體，以2-巰基乙醇（DMEM/F12）接觸培養(yǎng)將其誘導定向分化成神經(jīng)樣細胞。關(guān)于二種實驗方法的效果比較未見相關(guān)報道。也未見借用HAM基質(zhì)作為載體和單用乳鼠視網(wǎng)膜細胞作為誘導劑這二種誘導方式效果比較的相關(guān)報道。

3 BMSCs體內(nèi)移植實驗

BMSCs移植入體后，如何從受體辨別供體干細胞，并觀察其在體內(nèi)的遷移變化情況，一直是讓人困擾的問題。近年來，主要運用的標記物有以下幾種。

3.1 超順磁性鐵納米顆粒(SPIO)。SPIO是研究發(fā)現(xiàn)的新型磁共振陰性對比劑，可在活體標記神經(jīng)干細胞。Frank等研究發(fā)現(xiàn)SPIO顆粒與轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合后標記干細胞比使用單純SPIO顆粒高100倍。陳舒澤等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SPIO的濃度對此有至關(guān)重要的影響：濃度過低無法達到較高的標記效率滿足MR的需要。在標記濃度為11.2mg/L左右時，既能達到較高的標記效率，又不影響視網(wǎng)膜前體細胞的體外生長增殖，但這與有些文獻報道不同。轉(zhuǎn)染劑結(jié)合SPIO并無短期或長期毒性作用。

3.2 溴脫氧尿嘧啶(BrdU)。BrdU是胸腺嘧啶類似物，移植的細胞與含有BrdU的培養(yǎng)基一起孵育，讓它取代胸腺嘧啶而摻入處于DNA合成期細胞的DNA中作為標記，用免疫熒光或免疫組織化學顯示移植的細胞。BrdU作為標記應選擇適當?shù)臐舛?，采用質(zhì)量濃度為10μg/mL的BrdU標記的了BMSCs與未做標記的細胞生長情況基本相同，在熒光顯微鏡下可見BrdU標記的MSCs細胞核被染色，未做標記的細胞不著色。

3.3 細胞熒光黃(LY)。顯微鏡下選取誘導后1 d形態(tài)和活性良好的細胞，將細胞爬片置于灌流槽中。電極拉制器拉制玻璃毛細管微電極，注入電極液后電阻范圍為8～12mΩ。調(diào)節(jié)微操縱器，使電極尖端接近細胞，利用特定的測試方波電脈沖形成封接，在電極尖端接觸細胞表面之前，向微電極加正壓。當接近細胞時，給予短暫負壓吸引。當電極尖端與細胞膜表面形成1～5 gΩ封接電阻時，用力吸破電極尖端上的膜片，LY通過記錄電極尖端擴散入所記錄的細胞內(nèi)，5～10min后，在Leica熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍片。

3.4 視網(wǎng)膜電圖。視網(wǎng)膜電圖是客觀有效地反映視網(wǎng)膜功能變化的一個敏感指標，b波反映了視網(wǎng)膜內(nèi)核層區(qū)域細胞的電活動，是視網(wǎng)膜缺血的敏感指標。用視網(wǎng)膜電圖、b波觀察骨髓間充質(zhì)干細胞視網(wǎng)膜下移植對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的影響。

3.5 熒光染料。4，6-二脒222苯基吲哚(DAPI)是一種藍色熒光染料，可被不同時期的細胞攝取并與DNA結(jié)合。把(DAP I)儲存液(Sigma)加入第2代BMSCs培養(yǎng)液中，至終濃度為50mg/L，37℃孵育染色1 h，Hanks平衡液沖洗6遍，消化、離心收集細胞，重懸于PBS中(106個/mL)，置于冰上待用，然后采用標記細胞直接在熒光顯微鏡下識別，陽性率達100%。神經(jīng)節(jié)細胞密度與內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度是檢測視網(wǎng)膜損傷修復程度的常用指標。用蘇木精-伊紅染色研究內(nèi)核層細胞結(jié)構(gòu)和排列情況，用尼氏染色是對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行定量研究。還有用綠色熒光染料(PKH-67)標記了BMSCs進行實驗。

4 動物模型與結(jié)果

4.1 正常模型

張枝橋等[6]把MSCs移植到同種異體成年大鼠視網(wǎng)膜下腔后14 d，主要分布于RPE層和視錐、視桿細胞層，證明MSCs能夠在視網(wǎng)膜下腔存活并能與原視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相融合；免疫熒光結(jié)果顯示，移植后的MSCs細胞并未表達光感受器細胞的特異性抗原Rhodopsin。對于這一陰性結(jié)果，認為原因可能有以下兩點：一是由于實驗條件所限，觀察時間太短，移植后的BMSCs可能還來不及發(fā)生分化，這一點可在下一步的實驗中通過延長觀察時間來證實。二是本實驗選用的受體為正常的成年大鼠，正常成年大鼠的視網(wǎng)膜與新生大鼠視網(wǎng)膜及非健康的大鼠視網(wǎng)膜相比，后者的微環(huán)境更有利于移植細胞的遷移、整合、分化，在這一微環(huán)境中起主要作用的可能是一些生長因子，如bFGF、NGF、GDNF、BDNF和CNTF等。而在正常成年大鼠的視網(wǎng)膜中，這些生長因子的水平相對較低，對移植細胞產(chǎn)生的趨化作用較弱，不利于移植細胞的整合、分化。大鼠MSCs移植于正常和Nd:YAG激光損傷后的大鼠視網(wǎng)膜下5周，MSCs可與原視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相融合分布于RPE層、視細胞層、雙極細胞層及節(jié)細胞層，ERG檢測表明損傷移植組的b波水平高于對照組。

4.2 損傷模型

光損傷模型：張鈺等[7]光損傷模型的制作：除N組外的SD大鼠經(jīng)過24 h暗適應，被放入光損傷儀中(北京大學醫(yī)學部儀器廠制作)光照24 h，光照強度為(950±50)lx，波長為480～520 nm，光照后置于黑暗中3 d，此后恢復到正常光環(huán)境，并在視網(wǎng)膜下移植BMSCs，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs可能是通過其分泌的細胞因子bFGF發(fā)揮其營養(yǎng)支持作用，從而對光感受器細胞產(chǎn)生保護作用，抑制了光損傷大鼠光感受器細胞的凋亡，但BMSC并沒有整合到大鼠視網(wǎng)膜組織中起替代作用。

注射3%NaIO3損傷RPE模型：在Lewis大鼠腹腔注射3%NaIO3(100mg/kg)建立大鼠RP模型，將體外培養(yǎng)的BMSCs植入視網(wǎng)膜下腔，術(shù)后第1周即可見BMSCs主要分布于RPE層和視錐、視桿細胞層，并從第3周開始表達RPE細胞及光感受器細胞的表面標志，但尚未需從功能上進行驗證。龔莉華等[8]用同一方法研究發(fā)現(xiàn)，誘導后的細胞表達RPE細胞、光感受器細胞和星形膠質(zhì)細胞的特異性標志，但沒有整合入神經(jīng)視網(wǎng)膜層，也沒有證據(jù)支持其分化為光感受器細胞。

視網(wǎng)膜缺血再灌注動物模型：用血管結(jié)扎法建立視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型。即是分離、暴露視神經(jīng)，在其根部用3/0滌綸線打活結(jié)，60 min后拆除結(jié)扎線，恢復血流。缺血再灌注損傷后28 d后視網(wǎng)膜下移植骨髓間充質(zhì)干細胞組與非移植組相比，移植組視網(wǎng)膜電圖b波增高，組織結(jié)構(gòu)破壞不顯著，內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度顯著增厚，研究認為骨髓間充質(zhì)干細胞對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護作用，且該作用與骨髓間充質(zhì)干細胞移植有關(guān)，而與磷酸鹽緩沖液無關(guān)。王陸飛等[9]眼缺血再灌注損傷的實驗模型是在右眼角鞏膜緣穿刺，注入BSS平衡鹽溶液，用間接檢眼鏡觀察，當眼內(nèi)壓上升到80 mmHg維持約60 min時，間接檢眼鏡下可見視網(wǎng)膜血管阻塞，視網(wǎng)膜變白，也可發(fā)現(xiàn)虹膜變白，此時終止眼內(nèi)灌注。以間接檢眼鏡確定血管再充盈后，用Br2dU標記的BMSCs進行視網(wǎng)膜下移植。然后做了BrdU陽性細胞連續(xù)切片的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)BMSCs在視網(wǎng)膜下移植后有一部分參與了視網(wǎng)膜的重建，一部分參與了損傷的增生，還有一部分形成了新的節(jié)細胞層增生。BMSCs的參與可以緩解缺血對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷，具有向損傷部位遷移的能力。證明了BMSCs能夠在視網(wǎng)膜下存活并能與原視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相融合，初步判斷形成的視網(wǎng)膜樣結(jié)構(gòu)具有神經(jīng)細胞特性，但尚不能確定這種新形成結(jié)構(gòu)是否能夠建立一定的神經(jīng)傳導。

5 鑒定

鑒定指標有以下幾種：(1)Nestin：為神經(jīng)巢蛋白，是神經(jīng)上皮干細胞蛋白，屬于中間絲蛋白，只在多潛能的神經(jīng)外胚層細胞中表達，是神經(jīng)干細胞特有的生物學標記。(2)生長相關(guān)蛋白(GAP-43)：是一種細胞骨架蛋白，特異性地分布于神經(jīng)元胞體及突起中，是軸突成熟的標志之一，國際上將GAP-43列為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復等神經(jīng)可塑性的首選分子標志物。(3)神經(jīng)絲(Neurofilament，NF)：屬于中間絲家族的第Ⅳ型，廣泛分布于成熟神經(jīng)元中。(4)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的特異性標志物Thy111檢測。但大部分的學者只用其中一種或幾種：王晶等[4]用免疫組織化學方法測定分化所得細胞的Nestin、NF表達；或應用免疫組織化學方法檢測神經(jīng)上皮干細胞蛋白Nestin、神經(jīng)元特異性標記物GAP-43的表達；劉東寧等[1]則檢測Thy111表達。

6 討論

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化出視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞為視神經(jīng)損傷等疾病的治療提供了新的方法。然而，由于對MSC來源的分化研究尚處于初級階段。盡管近年來對MSC的研究取得了很大進展，但仍然存在以下問題尚待解決：

（1）不同條件誘導骨骼間充質(zhì)干細胞定向分化成視網(wǎng)膜細胞所需微環(huán)境的是否存在蛋白差異，未被證實。

（2）還未形成相對有統(tǒng)一的、高效的誘導劑與誘導方法，未形成相對統(tǒng)一條件培養(yǎng)劑。

（3）體內(nèi)實驗中損傷模型的仿真程度還未經(jīng)進行實驗證實。正常視網(wǎng)膜與病變視網(wǎng)膜以及不同病變視網(wǎng)膜間的微環(huán)境對移植細胞的影響有何不同?

（4）雖然檢測到了RGCs標志物的表達，但未能在功能學以及電生理學等方面上證實視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞的功能。所以，骨髓間充質(zhì)干細胞其分化成的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞是否具有特定的功能，移植后與宿主神經(jīng)細胞整合發(fā)揮修復作用等尚有待進一步研究。

（5）骨髓間充質(zhì)干細胞對光感受器細胞產(chǎn)生保護作用機制未明了。是通過其分泌的細胞因子發(fā)揮其營養(yǎng)支持作用，還是整合到大鼠視網(wǎng)膜組織中起替代作用，還在探討中。

雖然MSCs移植目前尚不能應用于眼科臨床，但是已經(jīng)取得的研究成果表明MSCs移植有可能成為治療視網(wǎng)膜變性疾病的新的有效途徑。

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福建省重點科研課題（基金編號：2008Y0040）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。