絲素蛋白的相關(guān)生物學(xué)性能研究*

徐廣濤 林天送 周新妹 于海寧 徐國(guó)文 吳曉薇 鄭 漾 俞杭斌 陳士票

近幾年來(lái)，對(duì)蠶絲的應(yīng)用研究已經(jīng)從原來(lái)的紡織原料向醫(yī)藥、化妝品、食品和生化用品等領(lǐng)域延伸[1-3]。蠶絲柔軟、強(qiáng)韌、光滑又富有彈性，一直以來(lái)都是用作傳統(tǒng)的紡織材料，每年繅絲、織綢和服裝等企業(yè)產(chǎn)生大量蠶絲下腳料，這些下腳料未得到充分有效開發(fā)利用，不僅污染環(huán)境，也造成極大浪費(fèi)。筆者利用蠶絲下腳料提取絲素蛋白，進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)性能研究，探討其綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 電子天平sps202F型（常州稱重設(shè)備有限公司），分析天平AB204-N型（Mettler Toledo），紫外線分光光度計(jì)TU-1810（北京普析通用）。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，酵母膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 按文獻(xiàn)[4]方法將絲素蛋白人工配制成絲素肽、350 nm絲素粉、3 μm絲素粉、大分子質(zhì)量絲素肽和納米絲素粉（<100 nm）。將上述絲素蛋白與50%二甲基亞砜液按體積比為1∶2.3混合，得到納米絲素蛋白顆粒的混合液或懸浮液，反復(fù)離心脫水完全除去其中有機(jī)溶劑并進(jìn)行超聲處理，制成納米絲素蛋白液。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定 （1）平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)菌落濃度。用3支1 mL無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-5、10-6、10-7的稀釋菌液0.2 mL，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在對(duì)照板中加入同體積的無(wú)菌生理鹽水，后倒入熱熔后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約10～15 mL，迅速混勻，凝固后倒置于37℃溫室中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，觀察并取同一稀釋度2個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)進(jìn)行計(jì)算：每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度2次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。（2）貼板法測(cè)樣品對(duì)霉菌的抑菌效果。用圓形玻璃管將長(zhǎng)有霉菌的培養(yǎng)基取出，倒貼在含樣品培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上。分別觀察48 h和72 h后的菌落生長(zhǎng)狀況。（3）液體培養(yǎng)法測(cè)樣品對(duì)細(xì)菌的抑菌效果按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。樣品溶液濃度為1.0 g/L，并采用等體積樣品處理，對(duì)照組用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)試驗(yàn)區(qū)2個(gè)（分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）。培養(yǎng)液37℃震蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定各種樣品在560 nm的吸光度值（A值），比較細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3 抗紫外線活性的測(cè)定和研究 配制0.1%的各樣品溶液，在其未照射紫外線前進(jìn)行200～400 nm的全波長(zhǎng)掃描，得到各樣品的吸收光譜。1 h后分別在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度和200～400 nm處的吸收光譜，比較得出各樣品吸收紫外線能力的變化。再分別配制1%和10%的各樣品溶液，同上進(jìn)行200～400 nm全波長(zhǎng)掃描。

1.2.4 吸濕性和保濕性的測(cè)定 用飽和碳酸鈣溶液保持相對(duì)濕度，將5種樣品分別置于密閉容器中，分別測(cè)量24 h和48 h后的質(zhì)量（W1和W2），樣品原始質(zhì)量為W0。24 h吸濕率(%)=（W1-W0）/W0×100%，48 h 吸濕率 (%)=（W2-W0）/W0×100%。將吸濕48 h后樣品（W2）置于干燥容器中，分別再測(cè)量24 h和48 h后的質(zhì)量（W3和W4），計(jì)算24 h的保濕率(%)=［1-（W2－W3）/W2］×100%，48 h 保濕率(%)=［1-（W2－W4）/W2］×100%。

1.2.5 致敏性測(cè)定 將各樣品用50%二甲基亞砜溶解48 h，用蒸餾水稀釋得到0.5 g/L的絲素蛋白液。抽取皮膚無(wú)損傷、無(wú)皮膚病白色雌性豚鼠18只（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心），體質(zhì)量（300±10）g。隨機(jī)分為A組、B組和C組，每組6只。實(shí)驗(yàn)前24 h，對(duì)受試豚鼠進(jìn)行脫毛處理，進(jìn)行試驗(yàn)。（1）致敏接觸：A組、B組和C組動(dòng)物左側(cè)脫毛區(qū)分別涂以0.5 mL的絲素蛋白液、50%二甲基亞砜和1%2,4-二硝基氯苯（DNCB），給藥后用紗布和膠布固定，6 h后去除受試藥物，觀察0、24、48、72 h的過(guò)敏反應(yīng)情況。第7天和第14天，用同樣方法各重復(fù)1次。（2）激發(fā)接觸：于末次給藥(第14天)時(shí)A組、B組和C組動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)分別涂以0.5 mL的絲素蛋白液、50%二甲基亞砜和1%DNCB。方法同上。（3）過(guò)敏反應(yīng)平均分值和致敏率的計(jì)算。每只動(dòng)物均按皮膚過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，并計(jì)算各組的反應(yīng)平均值，即反應(yīng)平均值=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/合計(jì)動(dòng)物數(shù)。計(jì)算受試藥物的致敏率，即致敏率=出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)（無(wú)論程度輕重）陽(yáng)性的動(dòng)物數(shù)/受試動(dòng)物總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抑菌效果 平板菌落計(jì)數(shù)法結(jié)果表明金黃色葡萄球菌菌落數(shù)最多，枯草芽孢桿菌菌落數(shù)最少，見表1。絲素蛋白液對(duì)霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有顯著的抑菌效果。貼板法檢測(cè)表明，48 h后對(duì)照培養(yǎng)基、含絲素肽、350 nm絲素粉、3 μm絲素粉、大分子質(zhì)量絲素肽和納米絲素粉樣品的培養(yǎng)基中菌落大小分別為10 cm×10 cm、1.5 cm×1.5 cm、2.2 cm×1.4 cm、1.9 cm×1.5 cm、2.0 cm×1.7 cm、1.8 cm×1.5 cm。除350 nm絲素粉對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果相似外，其余絲素蛋白樣品溶液對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制效果，見表2。

表1 平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液

表2 液體培養(yǎng)法測(cè)定各樣品560 nm下的吸光度值

2.2 絲素蛋白吸收紫外線活性測(cè)定結(jié)果 0.1%未照射紫外線的5種絲素蛋白樣品對(duì)紫外線的最大吸收波長(zhǎng)在200～230 nm。經(jīng)紫外線照射1 h后，絲素肽、3 μm絲素粉、350 nm絲素粉吸收紫外線能力仍較強(qiáng)，見表3。1%和10%樣品溶液的吸光度為負(fù)值，以絲素肽為例，濃度較高的溶液所產(chǎn)生的抗紫外線能力并非較好，見圖1。納米絲素粉吸收波長(zhǎng)廣，且經(jīng)過(guò)10 min和20 min的紫外線照射后無(wú)明顯變化，在短時(shí)間的穩(wěn)定性較好，見圖2、3。

表3 5種0.1%絲素蛋白液未照射紫外線時(shí)吸收波長(zhǎng)和照射1 h后的吸光度

2.3 吸濕性和保濕性的測(cè)定結(jié)果 大分子質(zhì)量絲素肽和絲素肽的吸濕能力較其他的樣品強(qiáng)，48 h吸濕率分別為44.78%和35.30%。就48 h保濕率而言，3 μm絲素粉和絲素肽更強(qiáng)，分別為82.29%和78.91%，見表 4。

2.4 絲素蛋白的致敏性測(cè)定 5種絲素蛋白樣品經(jīng)豚鼠皮膚致敏接觸和激發(fā)接觸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明豚鼠皮膚對(duì)各絲素蛋白樣品均無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，以大分子質(zhì)量絲素肽為例說(shuō)明見表5。

3 討論

蠶絲蛋白包括絲素蛋白和絲膠蛋白2類。其中絲素蛋白與皮膚膠原蛋白同屬結(jié)構(gòu)蛋白，研究表明它具有良好的生物親和性、無(wú)毒、無(wú)污染[6]。本研究結(jié)果表明，絲素蛋白液對(duì)霉菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有顯著的抑菌效果，且對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果明顯優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果。通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改進(jìn)或者顆粒度研究，預(yù)計(jì)可以從中得到具有抗菌活性的新產(chǎn)品。

表4 各樣品的吸濕性與保濕性結(jié)果

表5 大分子質(zhì)量絲素肽對(duì)豚鼠皮膚致敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)紫外線照射1 h后，絲素肽、3 μm絲素粉、350 nm絲素粉的紫外線吸收仍較強(qiáng)，說(shuō)明它們的抗紫外線時(shí)間至少在1 h以上，表明絲素蛋白具有一定的紫外線防護(hù)作用，尤其以350 nm絲素粉的吸收范圍最廣。因?yàn)榻z素蛋白中的色氨酸、酪氨酸屬芳香族氨基酸，具有吸收空氣中紫外線的功能[7]。

大分子質(zhì)量絲素肽和絲素肽具有較好的吸濕能力，而3 μm絲素粉和絲素肽具有較好的保濕性，且對(duì)豚鼠皮膚均無(wú)致敏性反應(yīng)，筆者認(rèn)為可以用絲素蛋白進(jìn)行更廣泛的醫(yī)藥研究。

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