OMⅢ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒載體的構(gòu)建

李 楊，柳紀(jì)省,2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種感染偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，該病一旦爆發(fā)，將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是OIE規(guī)定的一類傳染病。FMDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約8.5 kb，由5′端非編碼區(qū)、一個(gè)開放閱讀框和3′端非編碼區(qū)和Poly（A）組成[2]。P1編碼區(qū)決定著病毒的抗原性和血清型[3]，其結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1位于全基因組的2 977～3 615核苷酸位點(diǎn)，編碼213個(gè)氨基酸，為主要抗原位點(diǎn)，可產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，是重點(diǎn)研究對(duì)象[4]。編碼FMDV的3種主要蛋白水解酶分別為L(zhǎng)、2A和3C基因。其中，3C是一種極為重要的功能蛋白，其在多聚蛋白的裂解及病毒衣殼的組裝過程中裂解病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1，最終得到成熟的病毒抗原[5]，還可使帽結(jié)構(gòu)宿主細(xì)胞蛋白的合成關(guān)閉，為病毒蛋白的合成創(chuàng)造條件[6]。鑒于在蛋白酶3C的作用下前體結(jié)構(gòu)蛋白P1最終裂解為 VP1、VP2、VP3、VP4[7]，組裝成為完整的病毒粒子誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[8]。筆者選用O型口蹄疫病毒的P1-2A和3C基因，以期獲得能夠高效表達(dá)具有免疫原性的FMDV抗原的重組腺病毒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

OMⅢ型口蹄疫病毒、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（穿梭載體pAdTrack-CMV、骨架載體pAdeasy-1）；大腸桿菌BJ5183（中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供）；HEK293細(xì)胞（由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)）；克隆載體pMD18-T、JM109、DNA Marker、Pyrobest DNA polymeras、T4DNA連接酶、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械龋ù筮B寶生物工程有限公司）；限制性內(nèi)切酶 PacⅠ、PmeⅠ、salⅠ、BglⅡ、xbaⅠ（Biolabs公司）；RNA提取試劑盒（Qiagen公司）；脂質(zhì)體lipofectAMINE2000（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank參考序列合成2對(duì)引物：P1-2A上 游 引 物 5′-ATAAGATCTACCATGGGAGCC-3′（引入 BglⅡ酶切位點(diǎn)）；P1-2A下游引物 5′-CGCGTCGACTGACATGTCCTC-3′(引入 salⅠ酶切位點(diǎn))。PCR 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃30 s，72℃ 3 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。3C上游引物 5′-GCGGTCGACAAGAAACCTGTC-3′（引入salⅠ酶切位點(diǎn)）；3C下游引物5′-ATATCTAGACTACTCGTGGTG-3′（引入 xbaⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。以上引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

按Qiagen公司的RNA提取試劑盒說明提取RNA，將總RNA用Oligo（dT）18引物在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42℃反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用2對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增P12A和3C，將目的片段按常規(guī)方法連接到pMD18-T載體上。用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，凝膠電泳鑒定后送大連寶生物工程有限公司測(cè)序鑒定。將連接產(chǎn)物分別用BglⅡ/salⅠ和salⅠ/xbaⅠ酶切，分別與經(jīng)同樣兩次酶切的腺病毒穿梭載體pAdTrack進(jìn)行連接，使其處于強(qiáng)啟動(dòng)子CMV控制下。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，抗性篩選陽(yáng)性克隆后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定，命名為pAdTrack-P12A3C。

1.4 OMⅢ型口蹄疫重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

pAdTrack-P12A3C經(jīng)PmeⅠ線性化后與腺病毒骨架載體pAdeasy-1共同電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌BJ5183，進(jìn)行PacⅠ酶切鑒定和PCR鑒定，該重組腺病毒質(zhì)粒命名為pAd-P12A3C。

1.5 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

用PacⅠ將pAd-P12A3C質(zhì)粒線性化后，在Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4～5 d細(xì)胞可觀察到綠色熒光，傳代后出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變。反復(fù)凍融后離心，取上清液接種于單層HEK293細(xì)胞，并依次傳至第10代。提取每代腺病毒基因組DNA，以此為模板擴(kuò)增FMDV的P1-2A、3C基因，檢測(cè)重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因P1-2A、3C的擴(kuò)增及重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

以篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別可見大小約2.3 kb和640 bp的片段條帶，與目的基因大小相符。將穿梭載體pAdTrack和T-P12A同時(shí)經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ和salⅠ酶切后進(jìn)行粘末端連接，鑒定連接成功后獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-P1-2A，再用限制性核酸內(nèi)切酶salⅠ和XbaⅠ同時(shí)酶切pAdTrack-P12A和T-3C進(jìn)行粘末端連接，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約2.9 kp的條帶，證明P12A和3C基因已成功克隆到了pAdTrack中（見圖1、圖 2、圖 3）。

圖1 O型FMDV 3C基因的擴(kuò)增

圖2 O型FMDV P1-2A基因的擴(kuò)增

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-P12A3C的鑒定

pAd-P12A3C質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ消化后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見大小約為4.5 kb的條帶，和預(yù)期結(jié)果相符。序列測(cè)定及分析也證實(shí)了目的基因已正確重組到腺病毒骨架載體內(nèi)（圖4）。

2.3 重組病毒遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)的檢測(cè)

分別提取1～10代細(xì)胞總DNA為模板進(jìn)行外源基因的PCR擴(kuò)增，每代均擴(kuò)增出目的基因，說明重組病毒能穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)染的單層HEK293細(xì)胞48 h后采用間接免疫熒光試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下可見特異的綠色熒光，而轉(zhuǎn)染腺病毒骨架載體的HEK293細(xì)胞經(jīng)同樣處理后無熒光，證明目的基因在腺病毒載體中成功表達(dá)，HEK293細(xì)胞中含有FMDV 蛋白（圖 5、圖 6、圖 7）。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定

圖4 重組腺病毒質(zhì)粒酶切鑒定

3 討論與結(jié)論

圖5 對(duì)照組正常HEK293細(xì)胞

圖6 接毒試驗(yàn)組

圖7 重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞后的綠色熒光表達(dá)

目前，世界多數(shù)國(guó)家都采用疫苗免疫的方法來控制FMD疫情，F(xiàn)MD基因工程疫苗的研究已經(jīng)歷20 a，由于免疫效果不及傳統(tǒng)的滅活苗，迄今僅有個(gè)別的產(chǎn)品上市，且市場(chǎng)占有率非常有限。究其原因，影響FMD基因工程疫苗免疫效力的因素較多，但其中最重要的原因之一是，不論原核表達(dá)還是真核表達(dá)，也不論是基因重組表達(dá)的亞單位疫苗還是用重組DNA進(jìn)行免疫的核酸疫苗，多數(shù)研究工作都是圍繞FMDV單個(gè)基因VP1在進(jìn)行不同途徑的探討，而一些能增強(qiáng)免疫作用的基因卻未被發(fā)現(xiàn)和利用[8]。2001年美國(guó)的Mary通過對(duì)FMDV全結(jié)構(gòu)蛋白基因及非結(jié)構(gòu)蛋白基因功能的研究，根據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白（3C蛋白酶）可將全部結(jié)構(gòu)蛋白基因P1的產(chǎn)物加工成結(jié)構(gòu)完整的VP1、VP2、VP3和VP4多肽，從而形成完整的病毒衣殼。因而，就能最大限度地保留病毒顆粒上的多個(gè)抗原表位的情況，研究了FMDVP1+3C活載體疫苗。用該疫苗免疫的豬在同居感染試驗(yàn)中，獲得了5/6的保護(hù)。這一試驗(yàn)結(jié)果表明，從全基因組水平篩選出的組合基因表達(dá)的融合蛋白的免疫效力已超過常規(guī)疫苗[9]。在口蹄疫活病毒載體疫苗研究中，目前FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因已在大腸埃希氏菌、畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因植物和桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá)[10]，腺病毒載體是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開發(fā)較早的一種病毒載體。其具有宿主范圍廣、對(duì)人致病性低、在增殖和非增殖細(xì)胞中感染、表達(dá)基因能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[11]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，腺病毒被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個(gè)領(lǐng)域[12]。

實(shí)驗(yàn)從FMDV全基因組水平篩選具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫組合基因（免疫基因的主序列）作為目的基因，將目的基因插入腺病毒表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體、電穿孔法轉(zhuǎn)化293細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。通過不同的分子檢測(cè)方法檢測(cè)，篩選出高效表達(dá)毒株。該試驗(yàn)為最終研制出安全、高效、實(shí)用的能表達(dá)FMD抗原的復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗提供了一些數(shù)據(jù)。

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