鱟試驗(yàn)法與家兔法同步檢測(cè)葛根素注射液的比較

王明樂,劉俊芳,崔 淇

葛根素注射液能改善微循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加腦部供血量、減緩心率、降低心肌耗氧指數(shù)、抗血管痙攣等。根據(jù)中國藥典2005年版家兔法,操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),本文對(duì)鱟試驗(yàn)法與家兔法進(jìn)行了比較試驗(yàn),結(jié)果如下。

1 主要材料

①鱟試劑:湛江安度斯生物有限公司(批號(hào)0711112, 0.25 EU/m L), 湛江博康海洋生物有限公司(批號(hào) 0708250, 0.25 EU/m L)。 ②細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所(2007 -6, 100 EU/支)。③細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水:湛江安度斯生物制品有限公司(批號(hào)0708220,內(nèi)毒素含量<0.003 EU/mL)。 ④家兔:購于中國人民解放軍第150醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 ⑤樣品:葛根素注射液 070908(熱原陽性), 070101, 070803,規(guī)格:2 m L/支。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度試驗(yàn)按《中國藥典》規(guī)定方法進(jìn)行試驗(yàn),鱟試劑靈敏度均在0.5 ～2.0 λ,結(jié)果符合規(guī)定。

2.2 限值(L)的確定根據(jù)《中國藥典》2005年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則,按公式L=K/M計(jì)算, K=5 EU/kg/h), M=20 m L/60 kg,求得L=15 EU/m L,本品為聯(lián)合用藥,規(guī)定20 m L在 4 h內(nèi)使用,除安全系數(shù)2,確定限值為7.5 EU/m L。

2.3 干擾試驗(yàn)在進(jìn)行干擾試驗(yàn)前,需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。即將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋,使用鱟試劑對(duì)每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn),每一稀釋倍數(shù)下做兩支供試品管(NPC)和兩支供試品陽性對(duì)照(PPC)(即含2.0 λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液),另做兩支陰性對(duì)照(NC)和兩支陽性對(duì)照(PC)。當(dāng)陰性對(duì)照為陰性,陽性對(duì)照為陽性,實(shí)驗(yàn)有效。系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液兩管為陰性,供試品陽性對(duì)照兩管為陽性時(shí),認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾試驗(yàn),此稀釋度30倍即為最小不干擾稀釋倍數(shù),正式干擾試驗(yàn)中,選擇該稀釋倍數(shù)供試品溶液及檢驗(yàn)用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2.0,1.0, 0.5, 0.25 λ。各濃度內(nèi)毒素溶液分別與兩種不同廠家鱟試劑(0.25 EU/mL)混合進(jìn)行干擾試驗(yàn),結(jié)果表明用BET水制的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es)在0.5 ～2.0 λ之間,并且用供試品稀釋液稀釋的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Et)在0.5 ～2.0 Es之間,證明供試品在該濃度下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用,結(jié)果見表1、表2。

表1 葛根素注射液干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 葛根素注射液(1∶30稀釋液)細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)

2.4 比較試驗(yàn)將兩批供試品分別進(jìn)行家兔法和鱟試驗(yàn)法比較實(shí)驗(yàn)。對(duì)家兔法檢查陽性樣品(批號(hào)070908)的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查筆者做過兩次重復(fù)試驗(yàn)均為陰性,結(jié)果見表3。

表3 葛根素注射液家兔法、鱟試驗(yàn)法試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

葛根素注射液是從野葛根中提取的單體異黃酮類化合物,具有擴(kuò)張腦血管,降低腦血管阻力,增加腦血流量,抑制血小板聚集,降低血黏度,改善腦循環(huán),提高腦組織對(duì)氧的攝取能力,并改善正?；蛉毖哪X組織代謝,挽救缺血暗帶區(qū),縮小梗死范圍[1]。葛根素注射液含有皂苷類化合物,對(duì)肝組織免疫損害具有保護(hù)作用,可有效逆轉(zhuǎn)化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化,增強(qiáng)心肌收縮力,保護(hù)心肌細(xì)胞作用,能擴(kuò)張血管、降低血壓、改善微循環(huán),保護(hù)紅細(xì)胞的變形能力,增強(qiáng)造血系統(tǒng)功能,具有抗血小板聚集,增加纖溶活性,降低血黏度作用,對(duì)腎炎、腎病腎衰模型均有保護(hù)作用,對(duì)非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫有明顯的調(diào)節(jié)作用,可促進(jìn)正常人和腫瘤病人的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,對(duì)干擾系統(tǒng)有明顯的刺激和誘生作用,在臨床上應(yīng)用廣泛[2]。臨床上可用于輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、視網(wǎng)膜動(dòng)、靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾及缺血性腦血管病、小兒病毒性心肌炎、糖尿病等[3]。葛根素注射液在該試驗(yàn)條件下,對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家兔法、鱟試驗(yàn)法試驗(yàn)結(jié)果一致。由于中藥注射劑的復(fù)雜性,在未弄清楚中藥注射劑的許多未知成分之前盡管此樣品可能不干擾內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng),也建議盡量不采用鱟試驗(yàn)法檢測(cè)。中藥注射劑是我國特有的劑型,多為衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)收載,均采用家兔法。按最新規(guī)定,原衛(wèi)生部頒標(biāo)準(zhǔn)收載的品種,如條件成熟的品種要轉(zhuǎn)為國家標(biāo)準(zhǔn),取消部頒和地方標(biāo)準(zhǔn),這樣中國藥典(2005年版)就肯定收載和增加更多的中藥品種。

中藥注射劑一般采用家兔法進(jìn)行檢查,但是家兔法操作復(fù)雜,鱟試劑法是重要經(jīng)典方法,與傳統(tǒng)的家兔法相比,具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本低、操作簡(jiǎn)便、易于掌握等特點(diǎn)。通過試驗(yàn)可以證明葛根素注射液用鱟試劑法和家兔法檢測(cè)都是可行的。

[1] 孫澤鈴,李以菊,閆玉芹.葛根素的臨床應(yīng)用[J].實(shí)用醫(yī)技雜志, 2006, 13(16):2830-2832.

[2] 陶志華.新藥葛根素的研究[J].中國新藥雜志, 1993, 2(2):32.

[3] 孫倩.葛根素治療急性腦梗死的療效及機(jī)制探討[J].新醫(yī)學(xué), 1999, 30(9):521-522.