鴨多殺性巴氏桿菌外膜蛋白A基因表達(dá)及抗原性鑒定

孫? ，郭東春 ，劉家森 ，姜騫 ，司昌德 ，林歡 ，韓凌霞 ，崔玉東 ，曲連東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室）

鴨巴氏桿菌病又叫鴨出血性敗血癥或鴨霍亂，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一種急性、敗血性傳染病。多種禽類都可感染，但以鴨、雞、鵝最易感[1]。雛鴨的發(fā)病率和死亡率較高。本菌革蘭氏染色為陰性，主要以其莢膜抗原和菌體抗原區(qū)分血清型，前者有5種，后者分為16個(gè)型[2]。到目前為止，分離的禽多殺性巴氏桿菌血清型主要是1：A、3：A和5：A，我國分離到的鴨多殺性巴氏桿菌以 5：A 為最多，其次為 8：A[3，4]。該菌正常存在于多種健康鴨口腔和咽喉部粘膜，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，抵抗力低下時(shí)，細(xì)菌侵入體內(nèi)，大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性傳染[2]。本菌廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被列為重點(diǎn)防治的疫病之一。

外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，鑲嵌于細(xì)胞膜的中間，在維持外膜結(jié)構(gòu)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，以及細(xì)菌對宿主的感染和致病過程等方面，起著重要的作用[5]。Omp A蛋白是外膜蛋白中的的一種重要的蛋白，這種蛋白是相對保守的，作為跨膜蛋白與宿主細(xì)胞外基質(zhì)相互作用從而達(dá)到粘附作用[6]。Dabo報(bào)道[7]，重組后的多殺性巴氏桿菌Omp A蛋白免疫小鼠能夠引起較強(qiáng)的TH2型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生較高的IgG抗體。

目前，關(guān)于多殺性巴氏桿菌Omp A蛋白的研究，國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究以鴨多殺性巴氏桿菌C48-102外膜蛋白A為研究對象，將去信號肽的Omp A蛋白進(jìn)行克隆，實(shí)現(xiàn)了該蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，Western-blot結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

多殺性巴氏桿菌株C48-102購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，大腸桿菌 TOP10、BL21（DE3）、質(zhì)粒 pPROEX-Htb由本室保存。

1.2 培養(yǎng)基

BHI培養(yǎng)基購自BD公司。

1.3 酶及主要試劑

Ex-Taq聚合酶、dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；鴨陽性血清由本室制備；HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG購自KPL公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 omp A基因的擴(kuò)增和克隆

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

按GenBank上登錄的多殺性巴氏桿菌Pm70序列（登錄號：AE004439），應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)兩對擴(kuò)增的omp A基因引物：

PAF2：5’ -CGTCGAGGATCATCCAAATG-3’；PAR2：5’-GCCCGTTACAATAGCCACG-3’

pPMEA2：5’-GCGGGATCCTATGTAGGTGCTAA AGCAG-3’（下劃線為BamHI位點(diǎn)）；

pEPMAR1：5’-CCCGTCGACTTATTTGTTACCTT TAAC-3’（下劃線為SalⅠ位點(diǎn)）

引物由上海invitrogen公司合成，其中，PAF2和PAR2為擴(kuò)增omp A全基因；pEPMAF1和pEPMAR1為擴(kuò)增omp A去信號肽的基因。

1.4.2 基因組DNA的提取

將多殺性巴氏桿菌C48-102劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫過夜培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單菌落，于 400 μL Lysis buffer（10 mmol·L-1Tris.Cl，0.5 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，2%SDS） 和終濃度為 100 μg·mL-1的 Proteinase K，置 55 ℃水浴消化2 h，冷卻至室溫后用酚/氯仿/異戊醇及氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用100 μLTE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR擴(kuò)增

PCR總體積為50 μL，反應(yīng)體系如下：10×Ex-Taq Buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 1 μL，Ex-Taq DNA 聚合酶0.5 μL，水36.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃變性30 s，52退火℃ 30 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，加到含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.4 克隆與鑒定

采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收，操作方法按上海華舜生物技術(shù)有限公司凝膠回收試劑盒操作說明書進(jìn)行。純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，培養(yǎng)過夜。篩選陽性重組克隆，送上海invitrogen公司測序。應(yīng)用DNAStar軟件對C48-102 omp A基因的測序結(jié)果與P52、PM 70、T931317、T94289 進(jìn)行比對分析。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將擴(kuò)增去信號肽的omp A用BamH I和Sal I酶切，同時(shí)用BamH I和Sal I酶切pPRO-EX-Htb質(zhì)粒，用DNA膠回收試劑盒將酶切的擴(kuò)增去信號肽的omp A和pPRO-EX-Htb回收，操作方法按試劑盒操作說明書進(jìn)行?；厥蘸蟮膒PRO-EX-Htb載體與omp A基因片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Sal I酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒Htb-omp A送上海invitrogen公司測序。

1.6 omp A基因的表達(dá)及SDS-PAGE分析

取測序正確的重組質(zhì)粒Htb-omp A轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值 0.4～0.6，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol·L-1，誘導(dǎo)表達(dá)5 h，同時(shí)設(shè)空白載體對照。用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.7 Western-blot分析

按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的NC膜在5%脫脂乳中封閉過夜，將膜浸入1∶50用5%脫脂乳稀釋的鴨抗多殺性巴氏桿菌陽性血清，37℃孵育1 h，用PBS洗滌3次，每次10 min，再加入到1∶2500倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG中，37℃孵育1 h，用PBS洗滌4次，以二氨基聯(lián)苯氨（DAB）為底物顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 omp A基因的擴(kuò)增與克隆

利用引物PAF2和PAR2成功擴(kuò)增了ompA全基因片段，擴(kuò)增片段大小為1062 bp（見圖1）。利用截?cái)嘈盘栯囊飌PMEA2和pEPMAR1擴(kuò)增片段大小為975 bp，編碼324個(gè)氨基酸（具體結(jié)果略）。

圖1 Omp A全基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR ampification of omp A gene

2.2 omp A的序列分析

C48-102 與 GenBank 中 P52、PM 70、T931317、T94289等多種血清型多殺性巴氏桿菌的omp A基因序列比對結(jié)果表明：在核苷酸水平上同源性為89.0%～98.9%；在氨基酸水平上同源性為90.7%～99.2%。

通過生物學(xué)軟件比對Omp A氨基序列發(fā)現(xiàn)，C48-102株Omp A蛋白全長為1062個(gè)氨基酸，C48-102株Omp A氨基酸序列只與B型多殺性巴氏桿菌P52存在部分的缺失，即63-64位、151-153位。

2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用引物pEPMAF1和pEPMAFR1擴(kuò)增的去信號肽的omp A基因與pPRO-EX-Htb構(gòu)建的重組質(zhì)粒Htb-omp A，用BamH I和SalⅠ雙酶切得到約1000 bp目的條帶，鑒定結(jié)果見圖2。同時(shí)，將重組質(zhì)粒Htb-omp A送上海invitrogen公司進(jìn)行測序，與原測序結(jié)果一致。

2.4 omp A基因的原核表達(dá)及Western-blot檢測

將重組質(zhì)粒Htb-omp A轉(zhuǎn)化BL21，用IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在大約35 kDa處有一條明顯的表達(dá)帶，與預(yù)期的分子量大小相符合（圖3A）。Western-blot的結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白具有較好的抗原性（圖3B）。

圖3 Omp A表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot檢測結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE and Western-blot analysis of the recombinant protein Omp A

3 討論

本研究采用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了鴨多殺性巴氏桿菌C48-102株omp A基因，整個(gè)ORF為1062 bp，編碼354個(gè)氨基酸，利用生物學(xué)軟件對omp A基因序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，C48-102菌株與其余已發(fā)表的不同血清型的多殺性巴氏桿菌P52、PM 70、T931317、T94289的序列比對結(jié)果表明：omp A基因在核苷酸水平上同源性為89.0%～98.9%；在氨基酸水平上同源性為90.7%～99.2%；C48-102株Omp A氨基酸序列只與B型多殺性巴氏桿菌P52株存在部分的缺失，血清B型P52株omp A全長1077 bp，比PM70和C48-102都長15 bp，多編碼4個(gè)氨基酸，鑒于GenBank中多殺性巴氏桿菌的omp A的序列有限，這與多殺性巴氏桿菌的血清型和毒力的相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

近年來，外膜蛋白對細(xì)菌致病機(jī)理和免疫性作用機(jī)理的研究取得了很大的進(jìn)展，這將有助于解釋外膜蛋白誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)的機(jī)理，以及外膜蛋白在誘發(fā)免疫應(yīng)答時(shí)與免疫細(xì)胞的相互作用。Omp A蛋白為跨膜蛋白，有研究表明，該蛋白除了具有維持外膜結(jié)構(gòu)的作用外，其主要作用是在細(xì)菌感染早期與細(xì)胞基質(zhì)相互作用，定植于宿主細(xì)胞[7]。外膜蛋白A序列具有很高的保守性，良好的免疫原性，可刺激體液免疫和細(xì)胞免疫[8]。據(jù)報(bào)道，重組的Omp A蛋白能夠引起強(qiáng)烈的Th2類型的免疫反應(yīng)，具有較高水平的IgG抗體產(chǎn)生等特點(diǎn)[7]。這些均表明該蛋白對禽巴氏桿菌的研究有著較深的理論基礎(chǔ)，為篩選多殺性巴氏桿菌omp A基因缺失株奠定基礎(chǔ)。

本研究所表達(dá)的成熟的Omp A蛋白是革蘭氏陰性菌外膜蛋白的一種重要成分。全基因表達(dá)產(chǎn)物由于攜帶有某些堿基干擾大腸桿菌的正常表達(dá)，這可能是由于Omp A蛋白整合到大腸桿菌外膜中，代替大腸桿菌外膜中原有的蛋白而發(fā)揮作用，從而使得大腸桿菌無法正常表達(dá)，因此截?cái)嗲?0個(gè)堿基的信號肽序列后，對大腸桿菌不產(chǎn)生任何干擾作用，外膜蛋白A在大腸桿菌中表達(dá)。

利用基因技術(shù)制備重組蛋白，關(guān)鍵是獲得能夠具有活性的單一的目的蛋白。本研究選擇pPROEX-Htb表達(dá)載體，該載體含有一段編碼6個(gè)組氨酸的基因，可與重組蛋白進(jìn)行高效融合表達(dá)，利用重組蛋白上組氨酸殘基能與Ni2+結(jié)合的特性，該蛋白能夠用His標(biāo)簽蛋白柱式純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，這種解離蛋白很容易被層析柱吸附，因此可以得到純度較高的目的蛋白，并且所純化的目的蛋白Omp A保持了抗原活性，為敲除omp A基因多殺性巴氏桿菌突變株的血清學(xué)檢測奠定基礎(chǔ)。

［1］B.W.卡爾尼.禽病學(xué)［M］.11版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［2］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［3］程安春，汪銘書，陳孝躍，等.256株鴨源多殺性巴氏桿菌血清學(xué)鑒定及病原特性研究［J］.中國獸醫(yī)科技.1997，27（7）：13-15.

［4］陳篤生，陳登杰，鄧培芳，等.四川省畜禽多殺性巴氏桿菌菌體抗原的血清學(xué)鑒定［J］.中國獸醫(yī)科技，1987（4）：28-29.

［5］Lin.J，Huang，.S，Zhang.Q.Outer membrane proteins：key players for bacterial adaptation in host niches［J］.Microbes Infect，2002，4（3）：325-331.

［6］Davies RL，Lee I.Sequence diversity and molecular evolution of the heat-modifiable outer membrane protein gene（omp A）of Mannheimia（Pasteurella）haemolytica，Mannheimia glucosidal， and Pasteurella trehalosi［J］.Bacteriol，2004，186（17）：5741-5752.

［7］Dabo SM，Confer A，Montelongo M.Confer.Molecular and immunological characterization of Pasteurella multocida serotype A：3 Omp A ：evidence of its role in P.multocida interaction with extracellular matrix molecules［J］.Microbial Pathogenesis，2003，35（4）：147-157.

［8］Robert L.Davies，Inkyoung Lee.Sequence Diversity and MolecularEvolution ofthe Heat-Modifiable Outer Membrane Protein Gene（omp A）ofMannheimia（Pasteurella） haemolytica，Mannheimia glucosida，and Pasteurella trehalosi［J］.J Bacteriol，2004； 186（17）：5741-5752.