奇智方對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和ICAM-1m RNA表達(dá)的影響

張淑霞

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動(dòng)因,它的功能障礙與腦血管病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有多種黏附分子,其中,主要介導(dǎo)白細(xì)胞黏附、移行的細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1),是導(dǎo)致和加重腦缺血狀態(tài)下組織損傷的重要因素之一。本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-304),進(jìn)行ICAM-1及其轉(zhuǎn)錄水平(ICAM-1 mRNA)表達(dá)的離體實(shí)驗(yàn)研究,觀察奇智方對(duì)血管內(nèi)皮功能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠,SPF級(jí),體重18 g～22 g,雄性。湖北省衛(wèi)生防預(yù)站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。合格證書:醫(yī)動(dòng)字第19-082。Wistar大鼠,SPF級(jí),體重190 g～210 g,雄性。湖北省衛(wèi)生防預(yù)站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。合格證書:醫(yī)動(dòng)字第19-084。

1.2 藥物 奇智方由黃芪、川芎、水蛭、膽南星、石菖蒲等組成,由湖北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室按95國家藥典標(biāo)準(zhǔn)配制成煎膏劑,用時(shí)用雙蒸水配成混懸液。西藥喜得鎮(zhèn)(H ydergin)片劑,每片1mg,天津華津制藥廠與瑞士山德士藥廠合作生產(chǎn)(批號(hào):960923),用時(shí)研碎加雙蒸水配成混懸液。

1.3 主要試劑與儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(美國A TCC),武漢大學(xué)細(xì)胞中心提供;D-MEM培養(yǎng)基:GIBCO公司產(chǎn)品;MTT試劑盒:SIGM A公司生產(chǎn);TMB試劑盒:AMRESCO公司生產(chǎn);羊抗鼠IgG-HRP:華美生物工程公司生產(chǎn)(批號(hào):GMH 51212);抗人CD54(ICAM-1)單克隆抗體及檢測試劑:SIGMA公司生產(chǎn)(貨號(hào):C7219);ICAM-1m RNA原位雜交檢測試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司。

酶標(biāo)儀:UIRION Reader A(英國);二氧化碳培養(yǎng)箱:Forma Scientific;超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn);培養(yǎng)板:Costar公司產(chǎn)品;二氧化碳:武漢無機(jī)鹽廠生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 Wistar大鼠含藥血清制備:取大鼠25只,隨機(jī)分成5組,每組5只。對(duì)照組大鼠灌服生理鹽水15 mL/kg;中藥高、中、低劑量組大鼠灌服中藥40g/kg、30g/kg、10g/kg;陽性對(duì)照組大鼠灌服喜得鎮(zhèn)0.27 mg/kg。每只大鼠灌胃給藥共5次,即每天早、晚各給藥1次,連續(xù)2 d,第3天早上再給藥1次。于末次給藥后1 h,從大鼠心臟采血,置4℃冰箱過夜,吸取血清,并將各份血清進(jìn)行等量混合后,56℃30 m in滅活處理,置-20℃低溫保存?zhèn)溆?。KM小鼠含藥血清制備:取小鼠100只,每組20只。對(duì)照組小鼠灌服生理鹽水25 m L/kg;中藥高、中、低劑量組小鼠灌服中藥50 g/kg、37.5 g/kg和12.5 g/kg;陽性對(duì)照組小鼠灌服喜得鎮(zhèn)0.4 mg/kg。每只小鼠灌胃給藥共5次,方法同大鼠。于末次給藥后1 h,眼眶取血,分離血清,方法同大鼠。

1.4.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),將生長成致密單層的HUECV-304細(xì)胞用0.25%胰酶消化。在室溫下放置10 min,倒去消化液,加入10 m L培養(yǎng)液,制成細(xì)胞懸液。接種于96孔板,每孔0.2 m L。置培養(yǎng)箱37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng),細(xì)胞生長至底面積的70%～80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 藥物抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧試驗(yàn) 取大、小鼠含藥血清及正常血清(每孔40μL)、生理鹽水(每孔40μL)加入96孔組織培養(yǎng)板中。將96孔組織培養(yǎng)板放入缺氧槽內(nèi),在密封條件下,充入大量的氮?dú)?37℃放置30 min后取出,放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;再放入缺氧槽內(nèi)30 min,又放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在缺氧試驗(yàn)開始后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h分別觀察細(xì)胞生長情況以及于缺氧試驗(yàn)第0 h、2 h、6 h、16 h,測定大、小鼠含藥血清對(duì)其ICAM-1的表達(dá)情況。在48 h測定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性(MTT法)。

1.4.4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)測定(ELISA法) 在缺氧試驗(yàn)后的0 h、2 h、6 h、16 h時(shí)段分別按劑量組取出培養(yǎng)的96孔細(xì)胞板。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作。

1.4.5 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性測定(M TT法) DME培養(yǎng)液加入經(jīng)56℃、30 m in滅活的新生小牛血清終濃度為10%。將生長致密單層的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化,室溫10 min,倒去消化液,加入10 m L培養(yǎng)液,反復(fù)吹打,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/m L,將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 m L,中藥高、中、低劑量組、喜得鎮(zhèn)陽性對(duì)照組(陽性對(duì)照組),另設(shè)生理鹽水對(duì)照組(生理鹽水組)、血清對(duì)照組(正常血清組)加無菌PBS,每組作4個(gè)～5個(gè)平行孔,置5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 m L;加入0.7 m L不含小牛血清DME培養(yǎng)液,同時(shí)加入MTT每孔50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入1 m L酸性異丙醇溶液,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解,然后分裝到96孔酶表板中,每個(gè)劑量組分裝4孔～5孔作為平行標(biāo),用酶標(biāo)儀以570 nm波長測定光密度值。

1.4.6 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)測定 細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng),條件為37℃和5%的CO2,所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1 mol/L PBS(PH 7.4)洗2 m in,每分鐘3次。用含有1/1 000 DEPC的4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS固定培養(yǎng)細(xì)胞,室溫,固定30 m in～60 m in。新鮮配制0.5%H2O2/甲醛室溫處理30 min,蒸餾水洗滌3次。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃消化30 s～120 s。0.5mo l/L PBS洗3次,每分鐘5次。蒸餾水洗1次。按每張切片20μL加預(yù)雜交液,放入濕盒中,恒溫箱37℃～40℃2 h～4 h。吸取多余液體,不洗。按每張切片20μL雜交液,放入濕盒中,恒溫箱37℃～40℃雜交過夜。雜交之后的樣本用30℃～37℃水溫的2×SSC洗滌5 min,每分鐘2次,0.5×SSC洗滌15 m in,每分鐘1次,0.2×SSC洗滌15 m in,每分鐘1次。之后,滴加封閉液,37℃30 min。甩去多余液體,不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60 min,0.5mol/L PBS洗滌5 m in,每分鐘4次。滴加SABC,37℃20m in,0.5mol/L PBS洗5 m in,每分鐘3次。滴加生物素化過氧化物酶:37℃20 m in,0.5 mol/L PBS洗5 m in,每分鐘4次。使用DAB顯色試劑盒,一般顯色20m in～30m in。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。酒精脫水,二甲苯透明,封片。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧試驗(yàn)后細(xì)胞生長情況觀察 正常細(xì)胞胞體呈多角形或梭形,相互嵌合為單層,呈鋪路石狀排列;缺氧試驗(yàn)后大鼠血清組和小鼠血清組細(xì)胞生長和形態(tài)變化基本一致。在12 h內(nèi)細(xì)胞處于生長休止?fàn)顟B(tài),無增殖現(xiàn)象;24 h中藥高劑量組和陽性對(duì)照組生長明顯,基本形成單層;48 h形成致密單層細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)基本正常。中藥中、低劑量組細(xì)胞生長情況較高劑量差;正常血清組和生理鹽水組的細(xì)胞形態(tài)隨時(shí)間延長細(xì)胞間隙增寬,折光度暗,細(xì)胞皺縮變形,胞漿濃縮并出現(xiàn)顆粒狀,24 h后開始出現(xiàn)脫落,48 h脫落明顯。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性測定結(jié)果 經(jīng)MTT法檢測,其OD值結(jié)果顯示,血清組與生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),中藥各劑量組和陽性對(duì)照組與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01),大鼠藥理血清與小鼠藥理血清對(duì)HUVEC活性研究結(jié)果基本一致。3個(gè)不同劑量治療組的OD值表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系,即:奇智方抗缺氧效果呈劑量依賴性。詳見表1、表2。

表1 大鼠藥理血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性作用測定(±s)

表1 大鼠藥理血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性作用測定(±s)

組別藥物終濃度mg/m L OD值中藥高劑量組80 0.782±0.051中藥中劑量組60 0.689±0.019中藥低劑量組20 0.546±0.017陽性對(duì)照組0.2 0.735±0.017生理鹽水組—0.181±0.012正常血清組—0.201±0.027

表2 小鼠含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性作用測定(±s)

表2 小鼠含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性作用測定(±s)

組別藥物終濃度OD值中藥高劑量組10 g/(kg?m L)1.230±0.073中藥中劑量組7.5 g/(kg?m L)0.950±0.043中藥低劑量組2.5 g/(kg?m L)0.480±0.039陽性對(duì)照組0.08m g/(kg?m L)1.180±0.059生理鹽水組 -0.400±0.042正常血清組 -0.335±0.033

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)測定結(jié)果(見表3) 通過細(xì)胞培養(yǎng)和ELISA法測定發(fā)現(xiàn)HUVEC在正常情況下僅表達(dá)少量的ICAM-1蛋白分子,經(jīng)反復(fù)缺氧/復(fù)氧后2 h表達(dá)量開始升高,6 h～16 h達(dá)高峰;治療組及陽性對(duì)照組與血清組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),可明顯抑制HUVEC-304缺氧/復(fù)氧后6 h～16 h表達(dá)ICAM-1,中藥高劑量組與陽性對(duì)照組比較,效果更優(yōu),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中藥治療組不同劑量組比較呈明顯的量效關(guān)系。

表3 大鼠藥理血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)測定(±s)

表3 大鼠藥理血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)測定(±s)

OD值組別n 0 h 2 h 6 h 16 h中藥高劑量組6 0.203±0.007 0.273±0.0062)0.342±0.0072)0.415±0.0232)中藥中劑量組6 0.215±0.014 0.305±0.0062)0.396±0.0072)0.492±0.0172)中藥低劑量組6 0.214±0.008 0.295±0.0132)0.516±0.0072)0.617±0.0222)陽性對(duì)照組6 0.209±0.014 0.251±0.0062)0.361±0.0062)0.455±0.0172)正常血清組6 0.206±0.007 0.301±0.005 0.701±0.007 0.853±0.020生理鹽水組6 0.213±0.008 0.321±0.0052)0.795±0.0082)0.908±0.0161)與血清對(duì)照比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)測定結(jié)果(見表4)通過細(xì)胞培養(yǎng)、缺氧/復(fù)氧6 h和原位雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:在體外培養(yǎng)的HUVEC經(jīng)缺氧/復(fù)氧后,細(xì)胞內(nèi)ICAM-1m RNA轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào),與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥治療組和陽性對(duì)照組均能明顯使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞ICAM-1 m RNA下調(diào),與缺氧組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥治療組與陽性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 中藥對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧后ICAM-1m RNA表達(dá)的影響(±s)

表4 中藥對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧后ICAM-1m RNA表達(dá)的影響(±s)

組別n ICAM-1mRNA表達(dá)(%)正常對(duì)照組6 1.42±0.84缺氧組6 24.78±0.911)陽性對(duì)照組6 4.35±0.722)中藥治療組6 1.87±1.362)3)與正常對(duì)照組比較,1)P＜0.01;與缺氧組比較,2)P＜0.01;與陽性對(duì)照組比較,3)P＜0.05

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與血管壁內(nèi)皮下組織間的單層細(xì)胞。它并非單純官腔內(nèi)襯和屏障,而是具有抗凝、抗血栓形成、纖溶等廣泛生理功能的內(nèi)分泌器官。近幾年研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子(cy tokines),許多細(xì)胞因子可促進(jìn)黏附分子在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),如:細(xì)胞間黏附分子(ICAM)、細(xì)胞黏附分子(VCAM)、整合素(integrin)族黏附分子和選擇素(selectin)族黏附分子。黏附分子是由細(xì)胞產(chǎn)生,存在于細(xì)胞表面,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子[1,2],20世紀(jì)80年代后期,人們發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有多種黏附分子,其中,介導(dǎo)白細(xì)胞附壁滾動(dòng)的主要是選擇素家族,介導(dǎo)白細(xì)胞黏附、移行的主要是ICAM-1[3,4]。

ICAM-1屬于免疫球蛋白家族黏附分子,為單鏈跨膜糖蛋白,由5個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外區(qū)、1個(gè)較短的胞質(zhì)區(qū)組成,血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)較低,白細(xì)胞極少與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,即使偶爾黏附也很快分開,不影響血液循環(huán)。但是,在腦缺血等病理情況下,ICAM-1明顯上調(diào)[5],腦缺血再灌注后快速恢復(fù)的血流是加重缺血區(qū)損傷的重要原因[6],在缺血再灌注時(shí)局部血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞被病變組織產(chǎn)生的大量炎性介質(zhì)激活,細(xì)胞表面黏附分子數(shù)量和功能明顯上調(diào),造成白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞大量牢固黏附,白細(xì)胞聚集,進(jìn)而貼壁、滾動(dòng)、嵌塞微血管,造成局部血流動(dòng)力學(xué)改變;此外,活化的白細(xì)胞可以釋放大量的毒性物質(zhì)損傷神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,加重組織損傷。另外,白細(xì)胞還釋放一些炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子,加重炎性反應(yīng),并吸引更多的白細(xì)胞進(jìn)入組織,形成惡性循環(huán)。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動(dòng)因,它的功能障礙與腦血管病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腦缺血時(shí),可刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成多種細(xì)胞因子:IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等[7,8],從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子,增加中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,引起內(nèi)皮細(xì)胞的缺血損傷[5,9]。目前國內(nèi)外對(duì)腦缺血損傷黏附分子的研究尚處于起步階段,腦缺血損傷引起內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的一系列變化還沒有一個(gè)統(tǒng)一的概念,因此,研究轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平黏附分子的表達(dá)對(duì)深層次追蹤腦缺血損傷發(fā)生機(jī)制及干預(yù)防治具有重要的理論意義和臨床價(jià)值[10]。隨著ICAM-1所介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附增強(qiáng),在缺血性腦損傷中的作用日益明確,人們將開始尋找新的措施來預(yù)防和治療缺血性腦損傷[11]。

HUVEC-304是由人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系,可以表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志如Weibel-Palada小體、PA等,它可以進(jìn)行穩(wěn)定傳代培養(yǎng),是原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的良好模型[12]。本研究選用此細(xì)胞系作為研究對(duì)象,以反復(fù)缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)?zāi)M血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺血再灌注條件下的環(huán)境,能消除在體和離體血管中難以控制的神經(jīng)體液內(nèi)皮細(xì)胞的影響,更好地控制培養(yǎng)液中細(xì)胞所處的理化環(huán)境,并觀察藥物直接對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。

觀察研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)?zāi)苁寡軆?nèi)皮細(xì)胞活化而明顯表達(dá)ICAM-1和ICAM-1mRNA,奇智方能抑制其表達(dá),并呈明顯的量-效關(guān)系,提示:奇智方主要通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA的水平而影響其表面ICAM-1蛋白的表達(dá),抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化表達(dá)ICAM-1和ICAM-1mRNA可能是奇智方的免疫抑制機(jī)制的分子基礎(chǔ)之一。

[1] 金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)[M].西安:世界圖書出版社,1995:34-47.

[2] Bevilacqua MP.Endothelial-leukocyte adhesionmolecules[J].Annu Rev Immunol,1993,11:767.

[3] Rossler K,Neuch rist C,K itz K,et a l.Exp ression of leucocyte adhesion molecu les,at the human blood-braidbarrier(BBB)[J].J Neurosci Res,1992,31(2):365-374.

[4] Lassm ann H,Rossler K,Zim prich F,eta l.Expression of adhesion molecules and histocompatibility antigens antigens at the bloodbarrier[J].Brain Pathol,191,1:115-123.

[5] Zhang RL,Chopp M,Zaloga C,et a l.The temporal profiles of ICAM-1 p rotein and m RNA expression after transient MCA occlusion in the rat[J].Brain Res,1995,682(1):2182-2188.

[6] 周華東,張莉莉,陳曼娥.腦缺血再灌注ICAM-1的表達(dá)與神經(jīng)元損傷[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(2):115-118.

[7] Takahashi M,Masuyama J,Ikeda U,et al.Effect of endogenous endothelial interleukin-8 on neutrophil m ig ration acoss an endothelialmonolayer[J].Cardiovasc Res,1995,29(5):670-675.

[8] Feuerstein GZ,Liu T,Barone FC.Cy tokine,inflammation and brain inju ry:Role of tum or necrosis factor-alpha[J].Cereb rovasc Brain Metab Rev,1994,6(4):341-360.

[9] Qi J,K reu tzer DL.Fibrin activation of vascular endothelial cells:Induction of IL-8 expression[J].J Immunol,1995,155:2867-2876.

[10] 羅玉敏,秦震.內(nèi)皮細(xì)胞與腦缺血[J].國外醫(yī)學(xué):腦血管疾病分冊(cè),1998,6(5):271-273.

[11] 張曉彪,崔堯元,周良輔,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后皮層ICAM-1表達(dá)增加[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué),2000,8(4):276-281.

[12] 李建民,周勇,張麗,等.山茱萸總甙對(duì)HUVEC表達(dá)ICAN-1、CD 44的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2000,16(11):604-606.