骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化中褪黑素受體和多效蛋白的表達

連 霞,李 麗,李光來,李東芳,王荔,薛國芳

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向神經(jīng)細胞定向分化的可塑性使其有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞及基因治療理想的種子細胞[1]。但目前為止,經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細胞功能距離正常神經(jīng)細胞仍有較大差距,尚未找到確定穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法。因此有學(xué)者提出要得到確定穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法,必須先要了解MSCs向神經(jīng)細胞分化的具體機制。近期研究發(fā)現(xiàn),多效蛋白(p leiotrophin,PTN)對體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元有營養(yǎng)作用,可以促進其生長;褪黑素(melatonin,M el)有促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)系細胞分化的作用,并檢測到神經(jīng)干細胞表達PTN和Mel及其受體m RNA。這些都表明在神經(jīng)干細胞上存在PTN和Mel信號傳導(dǎo)系統(tǒng),它們參與了促進神經(jīng)干細胞的分化。同樣作為神經(jīng)前提細胞,MSCs在其向神經(jīng)系細胞分化中Mel受體和PTN m RNA是否表達,是本課題主要探討的內(nèi)容。

1材料與方法

1.1 材料 骨髓來源于健康成年志愿捐髓者;DM EM(Gibicol公司);胎牛血清FBS(杭州四季青);BME、DMSO(AMRESCO公司)、BHA(中國藥物試劑公司)、神經(jīng)元特異性醇化酶(NSE)、微管相關(guān)蛋白-2(M AP-2)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、羊抗兔二抗、SABC試劑盒(博士德公司);RNA PCR K it(AMV)Ver.2.1(TKaRa公司);寡核苷酸引物序列(大連寶生物);倒置熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、超靜工作臺;PTC-100型PCR儀;Kodark凝膠數(shù)字掃描分析系統(tǒng)等。

1.2 MSCs的分離培養(yǎng) 常規(guī)從髂后上棘行骨穿抽取肝素化骨髓4 m L,以淋巴細胞分離液(1.073×103g/m L)進行梯度分離,以5×106/L的細胞密度接種于25 m L的DMEM培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。3 d～4 d后首次換液,以后每隔3 d～4 d換液1次。每天在倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長速度。

1.3 MSCs的傳代培養(yǎng) 待細胞長至90%以上融合后傳代,按1∶3比例分瓶培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長速度。

1.4 MSCs體外誘導(dǎo)分化 取第6代的MSCs按4×105/m L接種于事先放置有消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層細胞。實驗組加入含1mmol/L的完全DMEM預(yù)誘導(dǎo)24 h[2],對照組加入無誘導(dǎo)劑的完全DM EM。24 h后去除培養(yǎng)液,加入PBS洗滌2次或3次。實驗組以含200μmo l/L BHA+2%DMSO的無血清DMEM作為誘導(dǎo)液處理,對照組不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)后0.5 h至4 d,觀察細胞形態(tài)變化并計數(shù)目。

1.5 免疫細胞化學(xué)鑒定誘導(dǎo)后神經(jīng)元樣細胞 誘導(dǎo)后12 h,4%多聚甲醛固定,封閉,加入含抗NSE、M AP-2、GFAP抗體(1∶200)作為一抗,置4℃過夜。PBS洗滌后滴加生物素化羊抗兔二抗,室溫20 min,加SABC室溫20 m in。最后用新配制的DAB液在室溫反應(yīng)5m in～30 m in,顯微鏡下監(jiān)測其顏色變化。從上下左右中等5個方位分別選取2個不重復(fù)的視野計算總細胞數(shù)及抗原表達率(NSE或MAP-2染色陽性細胞率)。

1.6 MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化中MT 1、M T 2和PTN的mRNA表達 誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后12 h檢測M T1、MT2和PTNmRNA的表達。總RNA提取后進行RNA甲醛變性凝膠電泳,檢測RNA純度后進行轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),按試劑盒使用說明進行,采用二步法,以GADPH為內(nèi)參照?？傮w積50μL,反轉(zhuǎn)錄cDNA后進行擴增,擴增條件分別為:94℃變性5m in后,94℃30 s,60℃30 s,72℃50 s,共35個循環(huán)。72℃延伸10 min和94℃變性2 m in,94℃30 s,57.5℃30 s,72℃1 m in,共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行電泳,結(jié)果分析采用KODAK ID凝膠電泳掃描分析系統(tǒng),將目的條帶做面積和灰度測定得出A值=待測條帶信號面積×條帶灰度值,然后利用作內(nèi)對照校正,即:待測PCR條帶相對豐度比值(ratio)=待測條帶A值/GADPH條帶A值,實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs的分離與原代培養(yǎng) 原代細胞接種24 h后少許細胞開始黏附貼壁,折光性強,呈圓形或橢圓形。3 d后全量換液即見變形細胞,有聚集生長傾向,呈梭狀或多邊形,伸出突起。后貼壁細胞迅速增殖,呈集落狀生長。8 d～10 d細胞呈集簇狀生長,中心呈放射狀或螺旋狀,基本融合。周邊細胞較分散,形態(tài)不完全統(tǒng)一。15 d～20 d基本鋪滿瓶底,集落中心細胞增殖明顯,周邊細胞與周圍的集落匯合,完全融合,輪廓不清楚,呈毛玻璃樣。

2.2 MSCs的擴增培養(yǎng) 傳代后生長潛伏期縮短,4 d～6 d可鋪滿瓶底,形態(tài),大小同原代細胞,仍呈現(xiàn)成集落狀生長。傳至第4代～第6代時細胞進一步純化,形態(tài)比較均一,高倍鏡下可見胞體有小的顆粒。傳至15代以上,細胞生長速度下降,呈逐漸衰老趨勢,折光性降低,高倍鏡下胞體顆粒增多,胞體逐漸出現(xiàn)空泡,最后懸浮死亡。

2.3 MSCs誘導(dǎo)分化后的形態(tài)變化 實驗組誘導(dǎo)后細胞形態(tài)開始發(fā)生變化,寬大扁平的細胞體開始向胞核收縮;誘導(dǎo)3 h后細胞胞體成圓形,折光性增強,出現(xiàn)雙極及多極細胞。12 h后變形細胞明顯增多,突起變長,交織成網(wǎng)格狀。持續(xù)至24 h一些細胞顯示出類似神經(jīng)元的細胞形態(tài),之后變形細胞增多不明顯,至誘導(dǎo)后3 d懸浮死亡細胞開始增多。對照組仍保持長梭型細胞形態(tài),未見神經(jīng)樣細胞出現(xiàn)。

2.4 免疫細胞化學(xué)鑒定及分化細胞的計數(shù) 顯微鏡下觀察各組NSE、MAP-2及GFAP染色陽性細胞數(shù),實驗組誘導(dǎo)后12 h細胞免疫化學(xué)染色顯示,大部分絕大多數(shù)形態(tài)改變的細胞均表達神經(jīng)元特異性標志NSE、MAP-2,而未檢測到GFAP的表達,與對照無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 MSCs誘導(dǎo)后12 h神經(jīng)細胞特異性抗原表達率比較(±s)%

表1 MSCs誘導(dǎo)后12 h神經(jīng)細胞特異性抗原表達率比較(±s)%

組別NSE MAP-2 GFAP對照組2.050±0.021 2.250±0.0231 2.000±0.022實驗組64.790±0.069 60.050±0.093 2.350±0.019 P＜0.01 ＜0.01＞0.05

2.5 MSCs誘導(dǎo)后PTNm RNA的表達(見表2、圖1、圖2)

表2 MSCs誘導(dǎo)后PTNmRNA表達的相對豐度比值比較(±s)

表2 MSCs誘導(dǎo)后PTNmRNA表達的相對豐度比值比較(±s)

組別誘導(dǎo)前誘導(dǎo)后12 h對照組0.209±0.020 0.184±0.0191)實驗組0.196±0.013 0.689±0.0171)2)與同組誘導(dǎo)前比較,1)P＜0.01;與對照組誘導(dǎo)后12 h比較,2)P＜0.01

圖1 PTN rt-PCR電泳圖譜

圖2 GADPH rt-PCR電泳圖譜

2.6 MSCs誘導(dǎo)后MT1 M T2 mRNA的表達(見表3) RTPCR產(chǎn)物中,可見大370bp MT1cDNA的陽性條帶,而未見大小約320bp M T2cDNA的陽性條帶呈陰性,未表達MT2亞型。對照組未擴增出陽性條帶,排除了總RNA中的污染基因組DNA引起的假陽性的可能。β-actin內(nèi)對照呈陽性,說明總RNA抽提物是正常的。

表3 MSCs誘導(dǎo)后MT1 m RNA表達的相對豐度比值(±s)

表3 MSCs誘導(dǎo)后MT1 m RNA表達的相對豐度比值(±s)

組別誘導(dǎo)前誘導(dǎo)后12 h對照組0.189±0.026 0.223±0.5061)實驗組0.190±0.012 0.778±0.0721)與同組誘導(dǎo)前比較,1)P＜0.01

3 討 論

2000年Woodbury等[2]發(fā)現(xiàn)MSCs在一定誘導(dǎo)條件下可向神經(jīng)元樣細胞分化。此后很多學(xué)者嘗試用不同的方法誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化,但是始終未能找到公認穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法。經(jīng)誘導(dǎo)分化后細胞功能距離正常神經(jīng)細胞仍有較大差距,存活時間短,不能有效增殖,難于應(yīng)用于體內(nèi)。鑒于此,許多學(xué)者認為,要找到確定穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法,必須清楚MSCs向神經(jīng)細胞分化的具體機制。目前研究認為MSCs的這種跨胚層或跨系分化的基礎(chǔ)最有可能是轉(zhuǎn)分化[3]現(xiàn)象。在分子水平上,轉(zhuǎn)分化發(fā)生在關(guān)鍵發(fā)育基因表達改變的基礎(chǔ)上,這些基因決定胚胎的各個區(qū)域發(fā)育為成體的不同部分。因此,了解這些關(guān)鍵基因的表達,對于探索MSCs分化的機制甚為重要。Pleiotrophin(PTN)以前稱為肝素結(jié)合樣生長因子-8,因其具有多種功能而被重新命名為多效蛋白。其基因PTN是高度保守的基因家族[4],可以啟動培養(yǎng)的胎鼠腦細胞軸突的生長發(fā)育,在神經(jīng)組織的發(fā)育和/或維持中起一定作用。故PTN也被稱為軸突生長刺激因子。近期研究發(fā)現(xiàn),PTN對體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元有營養(yǎng)作用[5]。并在神經(jīng)干細胞中高表達,并刺激其進一步分化為多巴胺能神經(jīng)元[6]。Furuta等[7]也檢測到神經(jīng)干細胞表達PTN及其受體mRNA。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)臍血來源的間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化后也表達PTNmRNA[8]。褪黑素在許多脊椎動物如雞、小鼠、綿羊等的胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。研究顯示褪黑素受體在人類胚胎的腦部組織中表達[9,10],特別是MT1亞型在人胚胎腦部組織中廣泛表達[11]。有研究報道Mel受體通過抑制環(huán)磷腺苷(cAMP)途徑,在視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中發(fā)揮作用[12]。Niles等[13]在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)系細胞分化過程中檢測到M el受體亞型mRNA的表達,Mel可能有增強神經(jīng)干細胞GDNF m RNA表達的作用。M oriya等[14,15]研究發(fā)現(xiàn)M el可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)系細胞分化。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可促進MSCs向神經(jīng)樣細胞分化[16]。這些都表明在神經(jīng)干細胞上存在PTN和Mel信號傳導(dǎo)系統(tǒng),并對神經(jīng)干細胞的分化有重要作用。MSCs同樣作為神經(jīng)前提細胞,其在向神經(jīng)系細胞分化中PTN和M T1的表達情況如何?；诖?本課題探討成人MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化中Mel受體和PTN mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)實驗組在誘導(dǎo)后12 h有Mel受體MT1亞型和PTN mRNA的表達,考慮MSCs在向神經(jīng)系細胞分化中PTN和Mel信號傳導(dǎo)系統(tǒng)可能也參與了細胞分化的調(diào)控。但具體作用如何,其表達有無變化,上下游的信號傳遞是怎樣的,通過調(diào)控其表達量是否能促進MSCs向神經(jīng)系細胞的分化則需要進一步的探索。

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