趙珅婷,趙 麗,喬健天,張 策
Humanin(HN)是一種由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽,是由日本科學(xué)家在老年癡呆(AD)患者腦內(nèi)未受損的腦區(qū)發(fā)現(xiàn)的。HN最初被認(rèn)為是一種針對老年癡呆相關(guān)損傷的特異性保護(hù)因子。然而,資料表明HN對缺血引起的PC12的細(xì)胞死亡也具有保護(hù)作用。提示HN可能不僅僅是一種特異性的神經(jīng)保護(hù)因子,它可能具有更廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察HN對缺氧引起的皮層神經(jīng)元的損傷是否具有保護(hù)作用,進(jìn)一步核實(shí)HN是否具有廣譜的神經(jīng)保護(hù)作用。
1.1 材料 健康Sprague-Daw ley(SD)大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、D-Hank's平衡液購于Gibco-BRL(Carlsbad,CA,USA)。谷氨酰胺、MTT、Calcein-AM和Humanin購于Sigma Chemical Co.(St Louis,MO,USA)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于中國南京建成生物公司。全自動酶標(biāo)儀(Elx800,基因公司,廣州),熒光顯微鏡(OLMPUS,Tokyo,日本)。
1.2 方法
1.2.1 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 無菌分離1 d~3 d大鼠額前皮層,無菌手術(shù)剪刀剪碎,0.125%胰蛋白酶消化10 m in,機(jī)械吹打至均勻分散。滅活胎牛血清(FBS)終止消化,0.22μm濾器過濾。800 g離心5m in后棄上清,用含10%FBS,4mmol/L谷氨酸,4.5 g/L D-葡萄糖和100 U的青霉素的DMEM/Ham's F12培養(yǎng)基稀釋沉淀。將細(xì)胞種植在提前包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿上。置于37℃,5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后加入阿糖胞苷阻止膠質(zhì)細(xì)胞分裂。通過相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。培養(yǎng)10 d后取生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 神經(jīng)元鑒定 培養(yǎng)10 d的細(xì)胞用4%甲醛固定20m in。PBS洗3次,每次5 min。用0.4%Triton配制的5%BSA室溫封閉1 h,PBS洗3次,每次5m in;抗MAP2一抗(1∶1 000)37℃2 h,PBS洗3次,每次5 m in;生物素化的二抗(1∶200)室溫1 h,PBS洗3次,每次5 m in;Cy3孵育37℃2 h,PBS洗3次,每次5min。用O lympusBX 40顯微鏡進(jìn)行觀察,圖片用IPP 4.5軟件進(jìn)行處理。
1.2.3 缺氧分組和HN處理 取培養(yǎng)10 d狀態(tài)良好的神經(jīng)元,對照組繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h,缺氧組置于缺氧孵箱內(nèi)(氧含量<2%)4h。藥物組分別于缺氧前24h加入終濃度為10μmo l/L和20μmol/L的HN。
1.2.4 MDA、SOD、LDH測定 依據(jù)南京建成生物公司試劑盒的說明書操作。
1.2.5 M TT測定 細(xì)胞種植于96孔板上。缺氧實(shí)驗(yàn)后每孔加入20μL 0.5 mg/m L MTT孵育4 h。棄上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床上放置10 m in。全自動酶標(biāo)儀490 nm波長進(jìn)行吸光度測定。細(xì)胞存活計(jì)算公式如下:(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白對照組吸光度)/(對照組吸光度-空白對照組吸光度)×100%。
1.2.6 Calcein-AM染色 Calcein-AM可以作為一種活細(xì)胞的熒光探針。缺氧后加入終濃度為20μmo l/L Calcein-AM 37℃孵育30 m in。D-Hank's平衡液沖洗3次,每次5 m in。使用OLMPUS熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
2.1 神經(jīng)元鑒定 細(xì)胞種植到培養(yǎng)皿上4 h~5 h后即可觀察到軸突生長。3 d后觀察胞體呈橢圓形或三角形,飽滿有光暈。可以看到單極或雙極神經(jīng)元。10 d后觀察細(xì)胞成熟,突觸生長良好,相互之間形成網(wǎng)絡(luò)狀。MAP-Cy3免疫組化顯示神經(jīng)元數(shù)目可以達(dá)到95%。
2.2 HN提高缺氧引起的細(xì)胞活力下降
2.2.1 MTT法檢測(見表1) 以對照組為100%計(jì)算,缺氧4 h可以引起細(xì)胞活性由100%降低到86.64%(P<0.05),缺氧前24 h加入10μmol/L HN可以保護(hù)細(xì)胞活性恢復(fù)至94.13%(P<0.05),而缺氧前24 h加入20μmol/L HN可以保護(hù)細(xì)胞活性恢復(fù)至97.10%(P<0.05)。
表1 不同濃度HN對缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用(±s)
表1 不同濃度HN對缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的保護(hù)作用(±s)
組別n細(xì)胞活性(%)對照組6 100.00±0.00缺氧組6 86.64±2.821)10μmol/L HN+缺氧組6 94.13±2.712)20μmol/L HN+缺氧組6 97.10±2.842)與對照組比較,1)P<0.05;與缺氧組比較,2)P<0.05
2.2.2 Calcein-AM染色 缺氧4 h后可以看到細(xì)胞的熒光活性明顯降低,并且可以看到有很多細(xì)胞碎片。缺氧前24 h加入10μmo l/L HN可以看到細(xì)胞熒光活性有了明顯改善,而缺氧前24 h加入20μmo l/L HN可以使細(xì)胞的熒光活性基本上恢復(fù)到正常水平。
2.3 HN抑制缺氧引起的細(xì)胞損傷
2.3.1 LDH檢測 缺氧4 h可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中LDH水平分別上升1.56倍和2.17倍(P<0.05)。缺氧前24 h加入10μmol/L HN可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中的LDH水平分別降低1.35倍和1.50倍(P<0.05)。缺氧前24 h加入20μmol/L HN具有更明顯的效果,可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中的LDH水平分別降低了1.07倍和1.37倍(P<0.05)。
表2 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中LDH的影響(±s)
表2 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中LDH的影響(±s)
組別n LDH(倍)細(xì)胞培養(yǎng)基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.56±0.061)2.17±0.031)10μmol/L HN+缺氧組6 1.35±0.042)1.50±0.042)20μmol/L HN+缺氧組6 1.07±0.092)1.37±0.022)與對照組比較,1)P<0.05;與缺氧組比較,2)P<0.05
2.3.2 MDA檢測(見表3) 缺氧4 h可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中MDA的生成分別上升1.83倍和1.69倍(P<0.05)。缺氧前24 h加入10μmo l/L HN可以使細(xì)胞中MDA的生成降低1.52倍(P<0.05),可以使培養(yǎng)基中MDA的生成降低1.65倍,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺氧前24 h加入20μmol/L HN具有顯著的抑制作用,可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中的LDH水平分別降低1.04倍和1.37倍(P<0.05)。
表3 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中MDA的影響(±s)
表3 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中MDA的影響(±s)
組別n MDA(倍)細(xì)胞培養(yǎng)基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.83±0.021)1.69±0.031)10μm HN+缺氧組6 1.52±0.012)1.65±0.01 20μm HN+缺氧組6 1.04±0.012)1.28±0.032)與對照組比較,1)P<0.05;與缺氧組比較,2)P<0.05
2.3.3 SOD檢測(見表4) 缺氧4 h可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中SOD活性分別上升1.22倍和1.29倍(P<0.05)。缺氧前24 h加入10μmo l/LHN可以使細(xì)胞中SOD活性降低1.0 3倍(P<0.05),可以使培養(yǎng)基中MDA的生成降低1.25倍,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺氧前24h加入20μmol/LHN可以使細(xì)胞和培養(yǎng)基中的SOD水平進(jìn)一步分別降低0.98倍和1.08倍(P<0.05)。
表4 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中SOD的影響(±s)
表4 不同濃度HN對缺氧后細(xì)胞和培養(yǎng)基中SOD的影響(±s)
組別n SOD(倍)細(xì)胞培養(yǎng)基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.22±0.041)1.29±0.011)10μm ol/L HN+缺氧組6 1.03±0.042)1.25±0.03 20μm ol/L HN+缺氧組6 0.98±0.012)1.08±0.042)與對照組比較,1)P<0.05;與缺氧組比較,2)P<0.05
Humanin是2001年由日本學(xué)者在老年癡呆患者的大腦皮層枕葉發(fā)現(xiàn)的一種由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽[1]。研究發(fā)現(xiàn),HN可以抑制由Aβ完整肽鏈及Aβ25-35片斷誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[2,3]。之后的研究發(fā)現(xiàn),HN除能拮抗Aβ引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡之外,還能拮抗家族性遺傳基因突變引起的神經(jīng)損傷。而對其他原因的損傷似乎不表現(xiàn)保護(hù)作用。因此,發(fā)現(xiàn)者將其定義為AD特異性的神經(jīng)保護(hù)肽。由于AD發(fā)病因素復(fù)雜,機(jī)制不清,缺乏有效的防治,因此,HN的發(fā)現(xiàn)受到了神經(jīng)科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注,被認(rèn)為有可能成為未來治療AD的有力工具。但隨著研究的逐步深入發(fā)現(xiàn),HN可以降低Ca2+超載,維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài);可以提高三磷腺苷(ATP)從而改善細(xì)胞功能[4];可以抑制Bax由胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體,從而抑制線粒體途徑的凋亡[5];可以抑制JNK-c-jun及FasL[6]的表達(dá),從而抑制死亡受體途徑的凋亡。HN的上述神經(jīng)保護(hù)機(jī)制強(qiáng)烈提示,HN不只是一種特異性針對AD相關(guān)損傷的神經(jīng)保護(hù)因子。因?yàn)闊o論是抗凋亡還是降低Ca2+超載或提高ATP改善細(xì)胞功能都不可能是只針對某一特定損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制。而且已有的一些實(shí)驗(yàn)研究也提示,HN對AD以外的損傷也具有保護(hù)作用,如HN可拮抗東莨菪堿等誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷以及缺血引起的PC12細(xì)胞的損傷[7]。鑒于上述因素,設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn),旨在觀察HN是否可以保護(hù)由缺氧造成培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷。
本實(shí)驗(yàn)采用的觀察指標(biāo)包括兩個(gè)方面,一是對細(xì)胞活力的檢測,包括M TT細(xì)胞活力分析及Calcein-AM染色,它們都可用來反映細(xì)胞活力從而確定細(xì)胞在缺氧及給予HN處理后存活率的變化。另一指標(biāo)體系是測定與缺氧損傷相關(guān)的三種物質(zhì)的變化:MDA、SOD、LDH[8,9]。MDA是一種在缺氧狀態(tài)下生物膜中多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊所形成的一種脂質(zhì)過氧化物,因而測定MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映細(xì)胞損傷的程度[10,11]。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合,SOD是以氧自由基連鎖反應(yīng)前體物O2-為唯一底物的天然酶類清除劑,構(gòu)成了機(jī)體抗活性氧的第一道防線[12]。SOD活性的高低可反映氧自由基水平。所以MDA的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度,而SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。此外,中樞神經(jīng)元中存在大量LDH,其化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定。通常情況下神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的LDH很少釋放,而神經(jīng)元受損后會引起LDH的大量釋放,因此LDH測定可反映神經(jīng)細(xì)胞損傷程度。
本研究中M TT的活性分析表明缺氧后細(xì)胞活性明顯降低,HN(10μmo l/L)可以使細(xì)胞活性提高,而HN(20μmol/L)的保護(hù)作用則更加顯著。Ca lcein-AM染色結(jié)果和M TT活性分析結(jié)果相一致,缺氧導(dǎo)致Calcein-AM染色陽性的細(xì)胞明顯減少,即有活性的細(xì)胞明顯減少。預(yù)先應(yīng)用HN(10μmo l/L)對缺氧的損傷即有保護(hù)作用,HN(20μmol/L)的保護(hù)作用明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為Calcein-AM陽性染色的細(xì)胞明顯增加。缺氧后LDH升高,說明缺氧引起細(xì)胞膜破裂,HN預(yù)處理后LDH的降低說明HN可以保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。同時(shí)HN可以降低缺氧導(dǎo)致的MDA的升高,M DA的升高說明缺氧后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng),而HN可以通過減少脂質(zhì)過氧化達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。雖然有很多研究報(bào)道細(xì)胞損傷后SOD的活性下降,但是在我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭腥毖鹾骃OD的活性升高,說明缺氧后細(xì)胞應(yīng)對外界損傷的抵抗作用增加。HN作用下SOD的降低也說明了外界的損傷減少,也可以從另一個(gè)角度說明HN可以降低外界損傷,對細(xì)胞起保護(hù)作用。
缺血缺氧是臨床較常見的腦損傷,HN對缺血缺氧損傷的保護(hù)作用機(jī)制不清,可能與HN可以直接作用于線粒體,提高細(xì)胞ATP的含量有關(guān);也可能與HN維持鈣穩(wěn)態(tài)及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān),確切的保護(hù)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究及本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的結(jié)果提示HN對氧化性損傷具有拮抗作用,可能和LDH、MDA、SOD相關(guān)。詳細(xì)的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
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