• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    茶樹葉面真菌與內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的比較

    2010-06-27 08:46:06張宇玲李小容楊民和
    生物災(zāi)害科學 2010年1期
    關(guān)鍵詞:葉面內(nèi)生茶樹

    張宇玲,李小容,楊民和

    (福建師范大學生命科學學院,福州 350108)

    植物葉片棲居有豐富的真菌群落。人們把附著于葉面并可以定居和增殖的真菌群體稱為葉面真菌(fungal epiphytes)[1];而將寄生于正常生長植物體內(nèi)的真菌稱為內(nèi)生真菌(fungal endophytes)[2]。已有的絕大多數(shù)研究都將葉面真菌和內(nèi)生真菌獨立進行。因此,葉面真菌與內(nèi)生真菌雖然生存的微環(huán)境相距不到1 mm,但人們對它們的種群結(jié)構(gòu)差異和相互關(guān)系知之甚少。近年來,由于微生態(tài)學理論和技術(shù)的飛速發(fā)展,人們逐步認識到植物葉圍(phyllosphere)微生物的種群和互作關(guān)系比人們預(yù)料的要更為復(fù)雜而多樣[3]。

    20世紀70年代以來,已有一些零星的報道對健康植物葉片上葉面真菌和內(nèi)生真菌作了比較研究。日本學者Osono實驗室對山茱萸(Swida controversa)、偃伏梾木(Cornus stolonifera)和純齒山毛櫸(Fagus crenata)等植物的葉面真菌和內(nèi)生真菌進行了分離和比較。研究結(jié)果表明,植物葉面和內(nèi)部組織生長有明顯不同的真菌群落,真菌的定植和分布受生長季節(jié)和葉片生育期的影響[4~7]。在咖啡(Coffea arabica)的健康葉片上,生長有豐富的真菌群落,內(nèi)生真菌和葉片真菌的種群差異明顯,交叉分布的種類很少;同時還發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌的物種多樣性比葉面真菌更為豐富;不同取樣地點的同種植物的葉片中,真菌群落也有差異[3]。相對于種類豐富、生態(tài)類型復(fù)雜多樣的植物,這些研究結(jié)果顯然不足于概述植物葉圍真菌的全貌。

    茶樹(Camellia sinensis)是一種重要的經(jīng)濟樹種,有關(guān)茶樹相關(guān)微生物的研究已經(jīng)積累了一些資料。在茶園土壤微生物、茶樹生長繁殖與微生物、微生物與茶葉加工貯藏、微生物與茶樹保護、微生物與茶的綜合利用等多方面都有相關(guān)的報道[8]。盧東升等對茶樹內(nèi)生真菌的種類及分布以及對豫南茶園樹棲真菌、芽及葉棲真菌群落及種群演替做了大量調(diào)查,并對茶園微生物及其應(yīng)用進行了很好的總結(jié)[9]。謝麗華等[10]對茶樹品種、葉片生育期和茶葉化學成份對內(nèi)生真菌的影響做過報道。但是,同時分離茶樹葉面真菌與內(nèi)生真菌,比較、分析它們的種群結(jié)構(gòu)及其差異,還未見相關(guān)的報道。本研究對茶樹葉面真菌與內(nèi)生真菌進行分離和鑒定,以期進一步了解其種群結(jié)構(gòu)及微生態(tài)關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 樣本采集

    從福建農(nóng)林大學園藝學院實驗茶園(福州金山)采集健康成熟的葉片,茶樹品種為黃旦和鐵觀音,在茶園這兩品種相鄰種植。采用五點取樣法,每品種每點分別取健康成熟葉片10片,共50片。成熟葉片指得是當年生長季節(jié)發(fā)出的,葉色嫩綠、角質(zhì)化不明顯的展開葉片。樣本編號后,裝入無菌紙袋,帶回實驗室后立即進行真菌的分離,或?qū)⒅参飿颖敬娣庞?℃冰箱中備用。

    1.2 葉面真菌

    采用兩種方法分離茶樹葉面真菌。分離方法1,葉片組織粘附法[3]:將采集的同一品種的茶樹葉片充分混合,然后隨機取20片,用直徑為0.5cm的無菌打孔器取葉片組織塊,從每一葉片隨機取6個組織塊,分別接入補加50mg/kg鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中,每直徑為9cm的培養(yǎng)皿中放入6~8個組織塊(3~4塊近軸面朝下),置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后,再在無菌條件下將葉片組織塊移出培養(yǎng)皿。將移走葉片組織塊的培養(yǎng)皿放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待出現(xiàn)菌落時,按菌落形態(tài)的不同,挑取少量菌絲進行分離純化。分離方法2,稀釋平板法:將采集來的同一品種的茶樹葉片混合,分別選取形狀大小相近的茶樹葉片10片,置于盛有100ml無菌水的三角瓶內(nèi),強力、反復(fù)振蕩15min后,制得菌懸液,稀釋10、100、1000倍3個不同濃度,用無菌吸管吸取0.2ml接種到PDA平板中,每個濃度梯度設(shè)3個重復(fù),涂抹均勻后置于28℃恒溫箱中培養(yǎng);待菌落長出后統(tǒng)計菌落數(shù)并挑取單菌落于PDA平板上純化培養(yǎng),用于菌類的鑒定。

    1.3 內(nèi)生真菌分離

    內(nèi)生真菌的分離參見謝麗華等[10]的方法。待葉片組織周圍出現(xiàn)菌體時,進行分離純化。

    1.4 真菌形態(tài)鑒定

    由于分離獲得的部分真菌在常規(guī)培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生繁殖體,按其在PDA培養(yǎng)基上的生長情況和菌落形態(tài)劃分為不同的形態(tài)型(morphospecies)。誘導產(chǎn)孢的方法如下:分離純化的真菌移接到PDA培養(yǎng)基或經(jīng)高壓滅菌的茶葉上,在28℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)。至菌絲長滿培養(yǎng)皿后,將培養(yǎng)皿取出,放置于室溫下繼續(xù)培養(yǎng);或在無菌條件下用接種環(huán)輕刮菌絲表面,誘導真菌產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)期間注意觀察真菌生長特征,隨時進行照相記錄。對在人工培養(yǎng)條件能產(chǎn)孢的真菌,參照魏景超和陸家云等的相關(guān)專著,進行真菌屬的初步鑒定;選擇優(yōu)勢種真菌(分離率≥30%)采用ITS序列分析鑒定。

    1.5 優(yōu)勢真菌ITS序列分析

    1.5.1 基因組DNA的提取 參照武漢琴等(2009)的方法進行。

    1.5.2 rDNA-ITS的擴增與序列測定 nrDNA ITS區(qū)用引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′,按程序:95℃預(yù)變性5 min;接以95℃30s,56℃30s,72℃30s,30個循環(huán);最后72℃保溫7min進行PCR擴增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。擴增的反應(yīng)體系( 25μl):超純水16.75μl,10×Buffer2.5μl,2mmol/L dNTP2.5μl,10μmol/L ITS4 1μl,10μmol/L ITS5 1μl,Taq酶0.25μl,模板1μl。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收、純化后送上海生工生物工程有限公司測序。

    1.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以每個菌株的ITS和5.8S序列作為靶序列,在GenBank中用BLAST程序搜索同源序列,挑選與菌株序列相近的參考序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Bioedit軟件編輯,Clustalx軟件將序列匹配排列,phylip3.67構(gòu)建ITS系統(tǒng)樹,選用鄰接法(Neighbor-joining)分析,每次搜索進行隨機1 000次重復(fù),獲得的自展檢驗(bootstrap)數(shù)值標記在分支上。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    葉面真菌和內(nèi)生真菌的分離率按以下公式進行:

    數(shù)據(jù)的顯著性分析采用t-檢驗:雙樣本等方差假設(shè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 茶樹葉面真菌與內(nèi)生真菌多樣性

    采用常規(guī)葉部真菌分離方法,依據(jù)PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的差異,從茶樹品種黃旦葉片上分離得到葉面真菌共26種形態(tài)型,其中15種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生繁殖體;內(nèi)生真菌18種形態(tài)型,其中6種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生繁殖體,葉面真菌與內(nèi)生真菌檢出率分別為100%和87.52%,其中分離率大于3%的共18種形態(tài)型。從茶樹品種鐵觀音葉片分離到葉面真菌16種形態(tài)型,其中10種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生繁殖體;內(nèi)生真菌15種形態(tài)型,其中7種在PDA培養(yǎng)基上能產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生繁殖體,葉面真菌與內(nèi)生真菌檢出率分別為100%和94.27%,其中分離率大于3%的共12種形態(tài)型。人工培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生繁殖體的真菌包括擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis spp.)、芽枝霉屬(Cladosporium sp.)、短梗霉屬(Aureobasidium sp.)、青霉屬(Penicillium spp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、球座菌屬(Guignardia sp.)、刺盤孢屬(Colletotrichum spp.)的真菌。本研究中,同時分離獲得一些人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢或難于產(chǎn)孢的、未鑒定的真菌。

    2.2 優(yōu)勢真菌鑒定

    對分離率大于30%的6種茶樹葉圍真菌,在形態(tài)學觀察的基礎(chǔ)上,進一步分析其ITS序列,采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建N-J樹,進行初步的鑒定。結(jié)果表明:菌株B1為Pestalotiopsis theae,菌株B2為Cladosporium cladosporioides(GenBank序列號:FJ216453),菌株B4為Botryosphaeria rhodina(GenBank序列號:FJ216454),菌株B8為Aureobasidium pullulans(GenBank序列號:FJ216455),菌株nsy-12為Guignardia mangiferae(GenBank序列號:EU671077),菌株N13確定為Colletotrichum sp.。

    2.3 兩種方法分離葉面真菌比較

    采用兩種分離方法均分離到4種相同的優(yōu)勢種葉面真菌。但從分離所得的真菌總數(shù)上,稀釋平板法所得葉面真菌種類(形態(tài)型)少于葉片組織黏附法所獲得的真菌;在茶樹品種黃旦上,采用稀釋平板法分離到葉面真菌15種形態(tài)型,而采用葉片組織黏附法獲得26種形態(tài)型;在鐵觀音上,采用稀釋平板法分離到葉面真菌12種形態(tài)型,而采用葉片組織黏附法獲得16種形態(tài)型。采用葉片黏附法獲得的4種優(yōu)勢真菌在茶樹品種黃旦、鐵觀音中的分離率無顯著差異(p<0.01),但采用稀釋平板法分離獲得的Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Aureobasidium pullulans在黃旦和鐵觀音中的相對分離率存在顯著差異(p<0.01),Botryosphaeria rhodina無顯著差異(p=0.33)(表1)。同時,采用不同分離方法,真菌數(shù)量也大不相同,如采用葉片黏附法,Pestalotiopsis theae在黃旦和鐵觀音中的分離率分別為90.57%和96.74%;而采用稀釋平板法,相對分離率分別只有7.47%和31.11%;其它3種真菌的數(shù)量也存在明顯的差異(表1)。因此,采用不同的葉片表面真菌分離方法,檢出真菌的種類和數(shù)量,均表現(xiàn)出明顯的差異。

    表1 葉面真菌兩種不同分離方法結(jié)果比較Table 1 Comparison of fungal epiphytes with two isolation methods

    2.4 茶樹葉面真菌與內(nèi)生真菌比較

    由表2可知,Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Botryosphaeria rhodina、Aureobasidium pullulans等4種真菌為葉面優(yōu)勢真菌,Guignardia mangiferae、Colletotrichum sp.等為內(nèi)生優(yōu)勢真菌,其中僅Pestalotiopsis theae為葉面優(yōu)勢真菌與內(nèi)生真菌所共有,其余葉面優(yōu)勢真菌均未在內(nèi)生真菌中分離得到,數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明兩群落的真菌組成存在顯著差異。

    在葉面真菌中,Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides、Botryosphaeria rhodina和Aureobasidium pullulans均能從同一茶葉組織塊中長出,特別是Pestalotiopsis theae、Cladosporium cladosporioides和 Aureobasidium pullulans,表現(xiàn)出高度重疊(>64.10%);內(nèi)生真菌中,Guignardia mangiferae 和 Colletotrichum sp.可以部分重疊,有22.33%~35.67%的Colletotrichum sp.和Guignardia mangiferae從同一組織塊中同時長出。而Pestalotiopsis theae 則一般單獨長出(表2)。

    表2 茶葉葉面真菌與內(nèi)生真菌優(yōu)勢種比較Table 2 Epiphytes vs endophytes in the six major fungal species isolated from tea leaves

    3 討論

    結(jié)果顯示,采用不同的分離方法用于分析真菌的種群數(shù)量和結(jié)構(gòu),能顯著地改變分離結(jié)果。葉片洗滌后稀釋平板分離法對那些以孢子粘附在葉面上的真菌計數(shù)較為準確,但以菌絲粘附的真菌則難以洗下。而在培養(yǎng)基上黏附一定時間后移走葉片組織塊,卻能分離到更多種類的葉面真菌。從葉片組織黏附法的分離結(jié)果看,移去茶葉組織塊,培養(yǎng)2d后即可見茶擬盤多毛孢的菌絲大量生長。因此,在PDA培養(yǎng)基上,茶擬盤多毛孢具有更強的生長能力。對照于稀釋平板法的結(jié)果(表1),可見茶擬盤多毛孢在茶葉表面的數(shù)量并不比芽枝狀枝孢霉和出芽短梗霉更多,但因生長能力強,加上組織黏附法對葉面的真菌沒有稀釋作用,因而生長迅速的真菌易造成對生長慢的真菌的抑制作用。除少數(shù)情況外[3],大多數(shù)研究者采用稀釋平板法分離葉面真菌。本研究的結(jié)果表明,采用兩種方法分離、分析植物葉面真菌,各有優(yōu)點。但由于這些方法均依賴于培養(yǎng)基的篩選作用,因而也存在明顯的缺陷。采用PCR擴增和變性梯度膠電泳技術(shù)(DGGE),Yang 等[12]在植物葉片表面洗滌液中檢測到豐富的微生物群落,其中許多種類在人工培養(yǎng)基上難于分離。因此,結(jié)合應(yīng)用人工分離和分子生物學技術(shù),能更為全面地反映自然條件下茶樹葉圍真菌群落結(jié)構(gòu)的真實情況。

    研究結(jié)果表明,茶樹葉圍維持有豐富的真菌物種多樣性;茶葉表面和內(nèi)部組織中,生長有完全不同的真菌群落。黃旦葉面真菌與內(nèi)生真菌的種類(p<0.01)與數(shù)量(p<0.05)均存在顯著不同,在黃旦葉片中葉面真菌的物種多樣性(26種形態(tài)型)遠大于內(nèi)生真菌物種多樣性(18種形態(tài)型);而在鐵觀音中,葉面真菌的物種多樣性(16種)與內(nèi)生真菌物種多樣性(15種)差異不大(p=0.55),但各種真菌的數(shù)量存在顯著差異(p<0.01)(表1,表2)。在茶樹葉圍占優(yōu)勢的6種真菌中,芽枝狀枝孢霉、出芽短梗霉和柑桔葡萄座腔菌只存在于茶葉的表面;而芒果球座菌和刺盤孢菌只生活與茶葉組織內(nèi)。茶擬盤多毛孢既可生活于茶葉組織內(nèi),也可生活于茶葉表面(表2);但茶擬盤多毛孢在茶葉表面占據(jù)優(yōu)勢,在茶葉內(nèi)部組織中則分布很少(<3%)。Santamaria & Bayman[3]對咖啡葉面真菌與內(nèi)生真菌進行了研究,共分離得到內(nèi)生真菌66種,葉面真菌63種,其中僅4種為葉面真菌與內(nèi)生真菌所共有;在葉面真菌中,Botryosphaeria sp.和Pestalotia sp.是優(yōu)勢種真菌;而在內(nèi)生真菌中,Xylaria sp.、Collerotrichum sp.和 Guignardia sp.是優(yōu)勢種真菌。在山茱萸(Swida controversa)、純齒山毛櫸(Fagus crenata)和偃伏梾木(Cornus stolonifera)的葉部真菌研究中,也得出相似的結(jié)果[4-7]。Osono[13]從山茶(Camellia japonica)葉片中分離得到真菌共79種,其中葉面真菌52種,內(nèi)生真菌44種,17種為葉面真菌與內(nèi)生真菌所共有;Pestalotiopsis sp.、Cladosporium cladosporioides.、Colletotrichum gloeosporioides、Aureobasidium pullulans等真菌作為優(yōu)勢種葉面真菌存在,而Geniculosprium sp.、Colletotrichum gloeosporioides 和 C.acutatum.則是內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢種;在優(yōu)勢種中,只有Colletotrichum gloeosporioides 為葉面真菌和內(nèi)生真菌種群所共有。和本研究的結(jié)果相比較,雖然同為山茶屬植物,茶樹和山茶葉面真菌的種群組成較為相似,但內(nèi)生真菌的種群組成則很不同。以上分析表明,在植物葉圍,不同物種之間優(yōu)勢種葉面真菌和內(nèi)生真菌的種類可能有不同;但在同一物種葉片上,葉面真菌與內(nèi)生真菌種群的組成均存在顯著的差異。前人研究還顯示,雖然植物葉圍真菌的物種多樣性非常豐富,但優(yōu)勢種真菌只是少數(shù)幾種[1-7,13]。本研究的結(jié)果支持這一結(jié)論。

    研究結(jié)果還顯示,在茶樹葉圍的優(yōu)勢真菌中,除茶擬盤多毛孢可以明確為茶樹葉部的病原菌,在一定條件下可導致茶樹輪斑病外,本研究分離獲得的其它葉圍真菌,特別是優(yōu)勢種真菌,在茶樹中均未有作為病原菌的記錄[14]。這些真菌可能在維持茶樹葉圍微生態(tài)平衡和病蟲害控制等方面發(fā)揮重要的作用。當然,有些真菌也可能是茶樹的非寄主(non-host)寄生物,在一定條件下能導致其它植物的病害。如芒果球座菌,是熱帶和亞熱帶植物葉部的常見內(nèi)生真菌,寄主范圍非常廣泛,但偶爾也能導致植物的病害[15]。像人體和動物腸道微生態(tài)系一樣,植物葉圍微生態(tài)系中微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量平衡,可能也會對植物健康產(chǎn)生深遠的影響。

    [1] 施雯, 張漢波.葉面微環(huán)境和微生物群落.微生物學通報, 2007, 34(4): 761-764.

    [2] Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves.In: Andrews J H, Hirano S S eds.Microbial Ecology of Leaves.New York: Springer Verlag, 1991, 179-197.

    [3] Santamar?a J, Bayman P.Fungal epiphytes and endophytes of coffee leaves (Coffea arabica).Microbial Ecology, 2005,50: 1-8.

    [4] Osono T, Mori A.Colonization of Japanese beech leaves by phyllosphere fungi.Mycoscience, 2003, 44: 437-441.

    [5] Osono T, Mori A.Distribution of phyllosphere fungi within the canopy of giant dogwood.Mycoscience, 2004, 45:161-168.

    [6] Osono T, Bhatta B K, Takeda H.Phyllosphere fungi on living and decomposing leaves of giant dogwood.2004,Mycoscience, 45: 35-41.

    [7] Osono T.Endophytic and epiphytic phyllosphere fungi of red-osier dogwood (Cornus stolonifera) in British Columbia.Mycoscience, 2007, 48 : 47-52..

    [8] 趙芹.茶微生物研究現(xiàn)狀.茶葉, 1999, 25(1): 18-19.

    [9] 盧東升.茶園微生物與茶園病害微生態(tài)控制.北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

    [10] 謝麗華, 徐焰平, 王國紅, 等.茶樹品種、葉片生育期和茶葉化學成份對內(nèi)生真菌的影響.菌物研究, 2006, 4(3):35-41.

    [11] 武漢琴, 蘇經(jīng)遷, 謝明英, 等.茶樹內(nèi)生木霉種的鑒定及其在植物體內(nèi)的定殖.菌物學報, 2009, 28(3):342-348.

    [12] Yang C H, Crowley D E, Borneman J, et al.Microbial phylloaphere population are more complex than previously realized.Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(7):3889-3894.

    [13] Osono T.Endophytic and epiphytic phyllosphere fungi of Camellia japonica : seasonal and leaf age-dependent variations.Mycologia, 2008, 100(3): 387-391.

    [14] 陳雪芬.中國常見茶樹病害.見: 中國農(nóng)業(yè)百科全書編輯部編著.中國農(nóng)業(yè)百科全書-茶業(yè)卷.北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1988.334.

    [15] Baayan R P, Bonants P J M, Verkley G, et al.Nonpathogenic isolates of the citrus black spot fungus,Guignardia citricarpa, identified as a cosmopolitan endophyte of woody plants, G.mangiferae (Phyllosticta capitalensis).Phytopathology, 2002, 92(5): 464-477.

    猜你喜歡
    葉面內(nèi)生茶樹
    噴施葉面阻隔劑對抑制小麥吸收鎘的效果初報
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動力
    葉面施鈣對冬棗品質(zhì)的影響
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動力
    山茶樹變身搖錢樹
    嶺石葉面鐵肥 缺鐵黃化
    兩個推薦茶樹品種
    茶樹灣
    女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产激情欧美一区二区| 精品福利观看| 美女免费视频网站| 国产午夜精品久久久久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲中文日韩欧美视频| 少妇粗大呻吟视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 91国产中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产精品久久久久久精品电影| 久久久久久久精品吃奶| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久香蕉精品热| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av熟女| 老司机午夜福利在线观看视频| 韩国av一区二区三区四区| 91字幕亚洲| 精品乱码久久久久久99久播| 青草久久国产| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲美女黄片视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲欧美98| 午夜日韩欧美国产| 久久久国产欧美日韩av| av在线天堂中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 国产av麻豆久久久久久久| 老司机靠b影院| 99热只有精品国产| 99精品久久久久人妻精品| 日本一本二区三区精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 1024手机看黄色片| 亚洲中文日韩欧美视频| av中文乱码字幕在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲成人久久爱视频| 脱女人内裤的视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美日本亚洲视频在线播放| av视频在线观看入口| 成人三级做爰电影| 又紧又爽又黄一区二区| www.999成人在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲av片天天在线观看| av国产免费在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99久久精品国产亚洲精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美中文综合在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 香蕉av资源在线| 日韩高清综合在线| 日日夜夜操网爽| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产69精品久久久久777片 | 国产精品一及| av福利片在线| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩大码丰满熟妇| 久久 成人 亚洲| 嫩草影视91久久| 黄色视频,在线免费观看| 成人国语在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 不卡一级毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 桃色一区二区三区在线观看| 成年版毛片免费区| 天堂√8在线中文| 99精品久久久久人妻精品| 成人精品一区二区免费| 亚洲自拍偷在线| 亚洲av熟女| 成人18禁在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久久久午夜电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 香蕉久久夜色| 黄色女人牲交| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品一区二区免费欧美| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产午夜精品久久久久久| 国产成人影院久久av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 身体一侧抽搐| 亚洲成人免费电影在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产欧美日韩精品亚洲av| tocl精华| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲av成人av| 成人手机av| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产亚洲欧美98| netflix在线观看网站| 午夜免费成人在线视频| 久久精品影院6| 成人av在线播放网站| 亚洲av成人精品一区久久| 黄色成人免费大全| 在线永久观看黄色视频| 91av网站免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品人妻少妇| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 九色成人免费人妻av| 日本 欧美在线| 性欧美人与动物交配| 亚洲成av人片在线播放无| 91国产中文字幕| 禁无遮挡网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 12—13女人毛片做爰片一| 男人舔女人下体高潮全视频| 黄色视频不卡| a在线观看视频网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久热在线av| 波多野结衣高清无吗| а√天堂www在线а√下载| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 999久久久国产精品视频| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久这里只有精品中国| 亚洲欧美激情综合另类| 国产99白浆流出| 久久久久久大精品| 两个人看的免费小视频| 精华霜和精华液先用哪个| www.www免费av| 成人欧美大片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 88av欧美| 婷婷丁香在线五月| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美三级三区| 国产v大片淫在线免费观看| 全区人妻精品视频| а√天堂www在线а√下载| 久久国产精品人妻蜜桃| 搡老岳熟女国产| 国产av又大| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲成人国产一区在线观看| 免费看日本二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 18禁美女被吸乳视频| 精品久久久久久久久久免费视频| av在线播放免费不卡| tocl精华| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久久久国产a免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 波多野结衣高清无吗| av超薄肉色丝袜交足视频| 免费观看精品视频网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产视频一区二区在线看| 欧美性猛交黑人性爽| 99热这里只有精品一区 | 麻豆成人av在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 美女免费视频网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人午夜高清在线视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美三级亚洲精品| 最好的美女福利视频网| 久久精品国产综合久久久| 国产av在哪里看| 国产精品九九99| 国产日本99.免费观看| 无限看片的www在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 99热6这里只有精品| 一本大道久久a久久精品| 国产成人系列免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久亚洲av毛片大全| 我要搜黄色片| 操出白浆在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产av在哪里看| a级毛片a级免费在线| 国产成人aa在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 此物有八面人人有两片| 五月玫瑰六月丁香| 成人手机av| 99国产精品99久久久久| 妹子高潮喷水视频| 哪里可以看免费的av片| www.www免费av| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美三级亚洲精品| 国产精品,欧美在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜日韩欧美国产| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日韩高清综合在线| 99热这里只有精品一区 | 18禁美女被吸乳视频| 精品久久久久久成人av| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜免费观看网址| 日本 欧美在线| 校园春色视频在线观看| 色综合婷婷激情| 国产男靠女视频免费网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 色老头精品视频在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费观看人在逋| 国产视频内射| 看免费av毛片| 亚洲精品在线美女| 黄片小视频在线播放| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品久久蜜臀av无| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久亚洲精品不卡| 一级片免费观看大全| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产伦人伦偷精品视频| 校园春色视频在线观看| 婷婷亚洲欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 丝袜人妻中文字幕| 久久热在线av| 一区二区三区高清视频在线| 久久香蕉国产精品| 禁无遮挡网站| 一级毛片高清免费大全| www.自偷自拍.com| 亚洲av电影在线进入| 精品久久蜜臀av无| 久久国产精品影院| 免费高清视频大片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品国产清高在天天线| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产熟女xx| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av又大| 国产熟女xx| 国产av一区二区精品久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久这里只有精品19| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久香蕉激情| 无限看片的www在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 99riav亚洲国产免费| 午夜成年电影在线免费观看| 男人舔女人的私密视频| 欧美成人性av电影在线观看| 91麻豆av在线| 一二三四在线观看免费中文在| 免费在线观看完整版高清| 香蕉国产在线看| 9191精品国产免费久久| 在线观看一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 欧美日韩国产亚洲二区| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久国产成人精品二区| 国产精品一区二区精品视频观看| 十八禁网站免费在线| 精品日产1卡2卡| 少妇人妻一区二区三区视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99热6这里只有精品| 18禁观看日本| 国内精品久久久久久久电影| 最好的美女福利视频网| 国产单亲对白刺激| av天堂在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一区二区三区高清视频在线| bbb黄色大片| 12—13女人毛片做爰片一| 一本一本综合久久| 日本黄大片高清| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色成人免费大全| 高清毛片免费观看视频网站| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲五月天丁香| 午夜激情av网站| 色播亚洲综合网| 免费在线观看亚洲国产| 18禁观看日本| 国产成人aa在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 久9热在线精品视频| 我的老师免费观看完整版| 制服诱惑二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 老司机在亚洲福利影院| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美精品亚洲一区二区| 99riav亚洲国产免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜免费激情av| 亚洲熟女毛片儿| www.www免费av| 午夜两性在线视频| 1024手机看黄色片| 精品电影一区二区在线| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜免费成人在线视频| www国产在线视频色| 色在线成人网| 婷婷丁香在线五月| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 亚洲男人天堂网一区| 午夜精品一区二区三区免费看| АⅤ资源中文在线天堂| 看片在线看免费视频| 黄色视频不卡| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲国产欧美人成| 国产亚洲精品av在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品成人免费网站| 老汉色∧v一级毛片| 最近在线观看免费完整版| 国产高清视频在线播放一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲五月天丁香| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美色视频一区免费| 日韩免费av在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 婷婷精品国产亚洲av在线| 最新在线观看一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人三级做爰电影| 国产私拍福利视频在线观看| 窝窝影院91人妻| 欧美性猛交黑人性爽| 搡老熟女国产l中国老女人| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美激情久久久久久爽电影| 十八禁人妻一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久9热在线精品视频| 嫩草影视91久久| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 中文字幕最新亚洲高清| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品精品国产色婷婷| 日本熟妇午夜| 99riav亚洲国产免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜老司机福利片| av国产免费在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 波多野结衣高清作品| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日韩乱码在线| 又紧又爽又黄一区二区| 一级作爱视频免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩欧美在线二视频| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩乱码在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 在线观看日韩欧美| 亚洲美女黄片视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 91九色精品人成在线观看| 成人午夜高清在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 成人av在线播放网站| 亚洲成人久久性| 精品欧美国产一区二区三| 香蕉久久夜色| 色老头精品视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 欧美极品一区二区三区四区| 精品人妻1区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 麻豆成人av在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久中文字幕一级| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 老司机午夜福利在线观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久久久久午夜电影| 国产1区2区3区精品| 男女床上黄色一级片免费看| 黄色a级毛片大全视频| or卡值多少钱| 岛国在线观看网站| 国产精华一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 精品欧美一区二区三区在线| 久久天堂一区二区三区四区| 国产1区2区3区精品| 男女之事视频高清在线观看| 国产视频一区二区在线看| 女警被强在线播放| 成人三级黄色视频| 国产高清videossex| 九色成人免费人妻av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费看十八禁软件| 亚洲全国av大片| 成年女人毛片免费观看观看9| 一进一出好大好爽视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 全区人妻精品视频| 国内精品久久久久久久电影| 国产高清激情床上av| 中文字幕久久专区| 免费观看人在逋| 亚洲中文字幕日韩| 午夜老司机福利片| 午夜a级毛片| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品av久久久久免费| 国产精品免费视频内射| 可以在线观看的亚洲视频| 国产在线观看jvid| 男女那种视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美日韩精品网址| 1024手机看黄色片| 美女大奶头视频| 最新美女视频免费是黄的| or卡值多少钱| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产成人aa在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产探花在线观看一区二区| 91av网站免费观看| 久久国产精品影院| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久这里只有精品中国| 国产av麻豆久久久久久久| 大型av网站在线播放| 两个人的视频大全免费| 婷婷丁香在线五月| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本熟妇午夜| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 91老司机精品| 性色av乱码一区二区三区2| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 宅男免费午夜| 一本综合久久免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 人人妻人人澡欧美一区二区| 91大片在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲第一电影网av| 舔av片在线| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 91国产中文字幕| 丁香欧美五月| 成人一区二区视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美成人午夜精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 美女黄网站色视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 很黄的视频免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲专区字幕在线| 麻豆国产av国片精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日韩欧美在线乱码| 又大又爽又粗| 最好的美女福利视频网| 国产成人av激情在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲五月天丁香| 午夜成年电影在线免费观看| 成人国产一区最新在线观看| 女警被强在线播放| 日韩欧美精品v在线| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲激情在线av| 最新美女视频免费是黄的| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色尼玛亚洲综合影院| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 不卡av一区二区三区| 久久亚洲真实| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 美女大奶头视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 深夜精品福利| 欧美高清成人免费视频www| 欧美成人性av电影在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 两性夫妻黄色片| 午夜免费成人在线视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 一本一本综合久久| 精品人妻1区二区| 国产激情久久老熟女| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品一区二区精品视频观看| 黄片大片在线免费观看| 18禁观看日本| 国产久久久一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩欧美 国产精品| 国产精品永久免费网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| ponron亚洲| xxx96com| av超薄肉色丝袜交足视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 一区二区三区国产精品乱码|