納洛酮對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織髓過(guò)氧化物酶的影響

李艷麗,程春鳳

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154002)

缺血性腦血管病是神經(jīng)科常見(jiàn)疾病,缺血腦組織在血供恢復(fù)后會(huì)發(fā)生再灌注損傷,再灌注損傷中炎性細(xì)胞與炎性介質(zhì)可對(duì)微循環(huán)及腦組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。近年研究納洛酮在機(jī)體組織器官損傷、炎癥及休克等情況下有一定保護(hù)作用。本研究通過(guò)觀察納洛酮在腦缺血再灌注后對(duì)腦組織中髓過(guò)氧化物酶的影響來(lái)探討納洛酮的神經(jīng)保護(hù)作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

Wistar大鼠36只,體重320g左右,術(shù)前禁食過(guò)夜,自由飲水。大鼠隨機(jī)分為6組,每組各6只大鼠。分別進(jìn)行 MPO檢測(cè)、紅四氮唑染色及腦組織含水量測(cè)定等三種檢測(cè),每種檢測(cè)分為納洛酮治療組及生理鹽水對(duì)照組。大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制作參照 koizumi線栓法。所有大鼠均栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈,栓線采用頭端涂聚乙烯醇的尼龍漁線。M CAO后2.5h,拔出栓線1cm長(zhǎng)度,此時(shí)形成再灌注。供血從大腦前、后動(dòng)脈流入大腦中動(dòng)脈 ,再灌注前 5min,治療組腹腔注藥納洛酮1.5mg/kg,對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1.5mL。術(shù)中及清醒前均給予頭燈 (100w)照射,保持肛溫37.0℃左右,室溫24～ 25℃。再灌注2.5h后按實(shí)驗(yàn)的分組設(shè)計(jì)分別進(jìn)行腦組織取材、染色及生化檢測(cè)。

1.2 模型完成及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參照 Longa及 Bederon的5分制評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分,0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。將0分、1分及4分大鼠去除,并補(bǔ)足各組設(shè)計(jì)所需大鼠數(shù)量。

1.3 MPO試劑盒操作過(guò)程

再灌注后迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標(biāo)本表面血液后,于冰盤(pán)上在右側(cè)半球(缺血側(cè))視交叉處為中心,向后冠狀切取并精確稱重150mg腦組織,做 M PO檢測(cè)。MPO檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求進(jìn)行,并按試劑盒提供的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.4 紅四氧唑染色及梗死體積測(cè)定

缺血再灌注后迅速斷頭取腦,將大腦半球放入冰箱冷凍至半硬狀后取出,距額極1毫米處以1.0mm為厚度冠狀切片。將切片放入 2%紅四氮唑(2、3、5-氯化三苯基四氯唑,TTC)生理鹽水溶液中避光37℃孵育0.5h,充分顯色后切片照相,并用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行切片梗死體積計(jì)算。

1.5 腦組織含水量測(cè)定

將待測(cè)大鼠右側(cè)大腦半球取出后,在扭力天平上精確稱濕重后置于 100℃烘箱內(nèi)烘干 24h,再次稱重。腦組織含水量按(濕重-干重)/濕重計(jì)算,以%表示。

1.6 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑

鹽酸納洛酮:北京四環(huán)醫(yī)藥公司產(chǎn)品,M PO試劑盒;南京建成生物工程公司產(chǎn)品。TTC:上海華東師范大學(xué)化工廠產(chǎn)品。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)分

制作成功的大鼠中 4只出現(xiàn)傾倒,評(píng)分3分,32只向左轉(zhuǎn)圈 ,評(píng)分 2分。

2.2 各組 M PO含量檢測(cè)、腦組織含水量、梗死體積及應(yīng)用納洛酮對(duì)其影響

見(jiàn)表1。

表1 兩組腦組織 M PO含量、水含量及梗死體積檢測(cè) ±s,n=6)

表1 兩組腦組織 M PO含量、水含量及梗死體積檢測(cè) ±s,n=6)

▲與對(duì)照組比較,P＜0.05;●與對(duì)照組比較,P＜0.05;■與對(duì)照組比較,P ＜0.05。

3 討論

缺血的腦組織在恢復(fù)血供后會(huì)繼續(xù)出現(xiàn)腦損傷,再灌注損傷是腦缺血損傷全過(guò)程中的一個(gè)重要部分。研究表明,腦缺血后白細(xì)胞浸潤(rùn)主要位于梗死區(qū)周邊,再灌注后,則分布于整個(gè)缺血組織。白細(xì)胞浸潤(rùn)于缺血腦組織可阻塞微血管,損害血腦屏障,釋放氧自由基和蛋白水解酶,直接損害神經(jīng)細(xì)胞及誘導(dǎo)凋亡,使腦水腫及缺血加重。腦梗死患者缺血早期即有白細(xì)胞浸潤(rùn),其嚴(yán)重程度與病灶大小及預(yù)后有關(guān),并且這種白細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象可持續(xù)到缺血后一個(gè)月。抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)可增加腦血流量,改善腦功能,減輕腦損害及縮小梗死灶。腦缺血時(shí)浸潤(rùn)的白細(xì)胞成份主要是中性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞的嗜苯胺蘭顆粒中含有 M PO,其含量恒定,約占細(xì)胞干重的5%,該酶有使過(guò)氧化氫還原的能力,利用這一特點(diǎn)可測(cè)定該酶活力,因此,測(cè)定出 MPO的活力可以定量的反映出浸入組織內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)量。本研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用納洛酮后缺血再灌注腦組織 MPO活性明顯降低,與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明缺血區(qū)腦組織浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞數(shù)量減少,這將有利于改善腦缺血區(qū)微循環(huán)供血情況,同時(shí)也將減少中性粒細(xì)胞釋放生物活性物質(zhì)造成的組織損傷。納洛酮治療組腦組織梗死體積及水腫均有明顯減少,可能此種抑制白細(xì)胞在腦組織浸潤(rùn)的機(jī)制有關(guān)。研究證實(shí)腦缺血后缺血腦組織β-EP含量顯著增加[1]。機(jī)體損傷情況下中性粒細(xì)胞 CD18、CD54表達(dá)與β-EP升高呈正相關(guān)。納洛酮可以使休克大鼠中性粒細(xì)胞 CD18含量明顯降低[2],可以使大鼠腸缺血再灌注致肺損傷大鼠 M PO含量下降[3]。這提示納洛酮可以通過(guò)降低 β-EP水平而減輕炎性損傷 ,納洛酮減少 M PO活性的作用可能為其能降低 β-EP(β-內(nèi)啡肽)有關(guān)。另外在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)納洛酮能明顯抑制中性粒細(xì)胞釋放超氧自由基陰離子,并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。這說(shuō)明納洛酮還有可能直接作用于中性粒細(xì)胞,減少其釋放損傷因子而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。納洛酮的作用機(jī)制較復(fù)雜,有可能減少缺血腦組織細(xì)胞凋亡[4,5],本實(shí)驗(yàn)中觀察到納洛酮降低了缺血腦組織 M PO活性,并減少了梗死體積,提示納洛酮可能具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,但納洛酮對(duì)缺血腦組織更進(jìn)一步的作用機(jī)理還不十分清楚,值得進(jìn)一步研究。

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